ヒト好中球における新しい細胞内顆粒の超微形態学的解析

人中性粒细胞新胞内颗粒的超形态分析

• 批准号: 09770016
• 负责人: 瀧澤 俊広
• 金额: $ 1.41万
• 依托单位: Jichi Medical University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1997
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1997 至 1998
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09770016/
• 关键词: ヒト好中球; 細胞内顆粒; GPIアンカー型蛋白質; アルカリ性フォスファターゼ; 好中球アルカリフォスファターゼスコア; 組織化学; 電子顕微鏡; 細胞生物学; 細胞化学・; 凍結割断レプリカ法

本研究の目的は、ヒト好中球の細胞内顆粒、特に従来の特殊顆粒とは異なるGPI(glycosyl-phosphatidylinositol)アンカー型蛋白質を含む新しい細胞内顆粒の特徴を明らかにすることである。特定の細胞内顆粒膜上に微量に存在するGPI蛋白分子(alkaline phosphatase(ALPase),CD16等)を高い解像力で同定し、その分布様式・動態を明らかにできる新しい形態学的解析法“レプリカ細胞化学(freeze-fracture cytochemistry)"を開発し、その解析を進めた。この手法を用いてGPI蛋白分子の分布様式を検討してみると、非刺激時にはALPaseは細胞内小顆粒の内表面に限局していること、又CD16は細胞内小顆粒と細胞膜表面の両方に分布していること等のGPI蛋白分子のユニークなトポロジーを初めて明らかにすることができた。次に凍結超薄切片を用いた好中球の組織化学により、GPI蛋白分子(ALPase)を含む小顆粒がエンドソーム(endosome)とは異なる細胞内小器官であることを確認した。又、更に形態学的解析を進めるために、蛍光顕微鏡で観察した蛍光シグナルを引き続き電子顕微鏡で直接観察する“correlative microscopy"法も開発した。一方、fMLP等の刺激に対するGPI蛋白分子、特にALPaseの動態解析を進めるために、従来のアゾ色素法とは異なるセリウム法を用いた高感度でしかも安定性のある光顕ALPase染色法を開発した。これにより、刺激後細胞内から細胞表面に急速にup-regulateされるダイナミックな動態変化をとらえることに成功した。この新しい染色法は、基礎医学的研究に留まらず、臨床においてより精度の高いNAPscore(neutrophil alkaline phosphatase score)検査法開発の有力な糸口となると考えられる。このように頂いた科研費により、ヒト好中球細胞内顆粒の超微形態学的特徴をかなりの部分まで明らかにすることができたが、骨髄中の成熟過程にある好中球でどの様にGPI蛋白分子が発現しているのか、分子生物学的解析が課題として残された。

は の purpose, this study ヒ ト の particles in the cell, the good に 従 の with special particles と は different な る GPI (glycosyl - phosphatidylinositol) ア ン カ を ー type protein contains new し む い の particles in cells, 徴 を Ming ら か に す る こ と で あ る. There are に trace amounts of に of するGPI protein molecules (alkaline) on the granular membrane of specific <s:1> cells Phosphatase (ALPase), CD16 as force, etc.) high を い solution で with し, そ の distribution others, dynamically を Ming ら か に で き る new し い morphological analytical method of "レ プ リ カ cytochemistry (freeze - fracture cytochemistry)" を open 発 し, そ の parsing を into め た. こ の gimmick を with い て GPI protein molecular の distribution others type を beg し 検 て み る と, non stimulation に は ALPase は small particles in the cell inner surface に の limit bureau し て い る こ と and CD16 は と small particles in the cell membrane surface の struck party に distribution し て い る こ と GPI proteins etc. の の ユ ニ ー ク な ト ポ ロ ジ ー を early め て Ming ら か に Youdaoplaceholder0 とがで た た. Time に freeze ultrathin slices を with い た の organization in good chemical に よ り, GPI (ALPase) を protein molecules containing む small particles が エ ン ド ソ ー ム (endosome) と は different な る intracellular small organ で あ る こ と を confirm し た. Again, more analytical を に morphology into め る た め に 蛍 light 顕 micromirror で 観 examine し た 蛍 light シ グ ナ ル を lead き 続 き electronic 顕 micromirror で す was 観 directly る "correlative microscopy" method も open 発 し た. One party, such as fMLP の stimulus に す seaborne る GPI proteins, に ALPase の dynamic analytic を into め る た め に, 従 の ア ゾ pigment method と は different な る セ リ ウ を ム method using い た Gao Gan degrees で し か も stability の あ る light 顕 ALPase staining を open 発 し た. こ れ に よ り, stimulate cells after か ら cell surface に に up sharply - regulate さ れ る ダ イ ナ ミ ッ ク な dynamic variations を と ら え る こ と に successful し た. The <s:1> <s:1> new <s:1> staining method えられる, basic medical research に leaves まらず, clinical にお てよ てよ <s:1> has high precision <e:1>, and the <s:1> NAPscore(neutrophil alkaline phosphatase score)検 examination method has developed a powerful な system for となると research えられる. こ の よ う に top い た KeYanFei に よ り, ヒ ト の superfine particles in good ball cell morphology of 徴 を か な り の part ま で Ming ら か に す る こ と が で き た が, bone marrow の mature process に あ る ball in good で ど の others に GPI proteins が 発 now し て い る の か, molecular biology of parsing が subject と し て residual さ れ た.

项目成果

Toshihiro Takizawa: "Correlative microscopy using fluoronanogold on ultrathin cryosections:proof of principle." J Histochem Cytochem. 46・10. 1097-1102 (1998)

Toshihiro Takizawa：“在超薄冷冻切片上使用荧光纳米金的关联显微镜：原理证明。”J Histochem Cytochem 46·10（1998）。

Toshihiro Takizawa: "Ultrastructural localozation o f enzymes in biomembranes as revealed by new enzyme cytochemical techniques." Acta Anat Nippon. 73・1. 1-7 (1998)

Toshihiro Takizawa：“新酶细胞化学技术揭示了生物膜中酶的超微结构定位”，Acta Anat Nippon 73·1（1998）。

瀧澤 俊広: "好中球における新しい細胞内顆粒-レプリカ細胞化学を用いた電顕細胞化学的解析-" 週間 医学のあゆみ. 187・3. 178-179 (1998)

Toshihiro Takizawa：“中性粒细胞中的新细胞内颗粒 - 使用复制细胞化学进行电子显微镜细胞化学分析”《医学史周刊》187・3（1998）。

Toshihiro Takizawa: "Freeze-fracture enzyme cytochemistry reveals the distribution of enzymes in biological membranes : Enzyme cytochemical label-fracture and fracture-label." Acta Histochem Cytochem. 30・1. 77-84 (1997)

Toshihiro Takizawa：“冷冻断裂酶细胞化学揭示了生物膜中酶的分布：酶细胞化学标签-断裂和断裂-标签。”Acta Histochem Cytochem 30・1（1997）。

Toshihiro Takizawa: "Freeze-fracture enzyme cytochemistry reveals the distribution of enzymes in biological membranes:Enzyme cytochemical label-fracture and fracture-label." Acta Histochem Cytochem. 30・1. 77-84 (1997)

Toshihiro Takizawa：“冷冻断裂酶细胞化学揭示了生物膜中酶的分布：酶细胞化学标记-断裂和断裂-标记。” Acta Histochem Cytochem 30・1 (1997)。