アルコールに対する生体反応タンパク質の解析と代謝過程の関係

エタノールの急性摂取時の生体反応タンパクの解析にあたり、転写制御因子に着目した。Wistar系雄ラットを用いて灌流実験を行った。実験後、肝臓を細胞分画した。核画分についてはゲルシフト法にて転写制御因子NF-κBおよびAP-1のDNA結合活性を検出した。細胞可容画分についてはwestern blottingを行って、IκBαを検出した。50mM EtOH灌流群についてはNF-κBのDNA結合活性が潅流20分で最大に達した後減少するのに対して、100mM EtOH灌流群では、経時的に上昇した。CYP2El代謝阻害剤を付加すると50mM EtOH灌流20分でのDNA結合活性は認められなかったが、60分後には活性はかなり上昇した。したがって、潅流20分におけるNF-κB活性の上昇にはCYP2Elを介する代謝系が関与していることが示された。しかしながら、阻害剤付加60分後では活性化したことから、EtOH潅流20分と60分の活性化に異なる機序の存在が示唆された。Western blottingによる検討では、IκBαはEtOH潅流20分で検出されないのに対して、60分後では再び検出されることから、異なるIκBが関与していることが明らかになった。このことは、p65の抗体を適用したsuper shift assayにおいても20分では抗p65抗体による著明なsupershiftが認められるのに対して、60分では認められなかったことからも裏付けられる。MAPKKKの一つであるMEKKlはIκBβのみを活性化することが知られている。そこで、MAPK cascadeによって活性化されるAP-1のDNA結合活性を調べたところ、EtOH濯流群で違いはなかった。したがって、少なくともMEKK1はMAPK cascadeの活性化を伴なう形ではEtOH灌流によるNF-κB活性化の2相性に関与しない可能性が高い。

エタノールの急性摂取時の生体反応タンパクの解析にあたり、転写制御因子に着目した。Wistar系雄ラットを用いて灌流実験を行った。実験後、肝臓を細胞分画した。核画分についてはゲルシフト法にて転写制御因子NF-κBおよびAP-1のDNA結合活性を検出した。細胞可容画分についてはwestern blottingを行って、IκBαを検出した。50mM EtOH灌流群についてはNF-κBのDNA結合活性が潅流20分で最大に達した後減少するのに対して、100mM EtOH灌流群では、経時的に上昇した。CYP2El代謝阻害剤を付加すると50mM EtOH灌流20分でのDNA結合活性は認められなかったが、60分後には活性はかなり上昇した。したがって、潅流20分におけるNF-κB活性の上昇にはCYP2Elを介する代謝系が関与していることが示された。しかしながら、阻害剤付加60分後では活性化したことから、EtOH潅流20分と60分の活性化に異なる機序の存在が示唆された。Western blottingによる検討では、IκBαはEtOH潅流20分で検出されないのに対して、60分後では再び検出されることから、異なるIκBが関与していることが明らかになった。このことは、p65の抗体を適用したsuper shift assayにおいても20分では抗p65抗体による著明なsupershiftが認められるのに対して、60分では認められなかったことからも裏付けられる。MAPKKKの一つであるMEKKlはIκBβのみを活性化することが知られている。そこで、MAPK cascadeによって活性化されるAP-1のDNA結合活性を調べたところ、EtOH濯流群で違いはなかった。したがって、少なくともMEKK1はMAPK cascadeの活性化を伴なう形ではEtOH灌流によるNF-κB活性化の2相性に関与しない可能性が高い。