ウィルソン病、メンケス病の病因である銅輸送ATPasesの酵素活性測定法の開発

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先天性銅代謝異常症であるウィルソン病およびメンケス病はその遺伝子解析から非常に類似した銅輸送ATPase(メンケス病、ATP7A;ウィルソン病、ATP7B)の異常であると考えられている。この銅輸送ATPaseの酵素活性の測定法を検討し、疾患細胞での銅輸送ATPaseの活性の有無を明らかにした。方法 1)銅輸送ATPaseの活性測定法の確立:ATP-7Bは膜蛋白で肝細胞ゴルジ体膜にあり、肝細胞内の銅輸送に関与している。そこで、正常ラットゴルジ体分画をサンプルとし、銅存在下でATP、ルシフェリン、ルシフェラーゼと反応させ、ATPの減少を生物化学発光測定システムで定量することにより、ATPaseの活性を種々の条件下で測定した。2)ウィルソン病モデル動物(LEC ラット)との比較:1)で確立した測定法により、正常とLECラットの肝細胞ゴルジ体分画でのATP7Bの活性を測定、比較検討した。結果および考察 1)正常ラットの肝ゴルジ体を用いた検討より、添加銅としてGSH-Cu(1価Cu)が望ましく、添加した銅濃度の上昇と共にATPase活性も上昇した。また、ゴルジ体サンプルの蛋白量とATPase活性の間にも相関関係が見られた。測定に使用するBufferはTris-H_2SO_4BufferがATP7Bの-SH基の保護をするので望ましいという結果を得た。以上の条件により、正常ラットサンプルを用いたATP7Bの銅濃度に対する酵素活性Km,VmaxはKm=1.82μM,Vmax=4.16nmol/mgProt/minであった。2)以上を検討した方法でLECラットと正常ラットにおけるCu-ATPaseの活性を比較したところ、LECラットの方が顕著に低下していた。すなわち、銅輸送ATPaseの活性測定面から、LECラット肝ではATP-7Bの機能障害があるという結果を得られた。