銅転送ATPasesの酵素活性測定の開発とウィルソン病、メンケス病の病態解析

铜转移ATP酶酶活性测定的发展以及威尔逊病和门克斯病的病理分析

• 批准号: 08670913
• 负责人: 児玉 浩子
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: Teikyo University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-08670913/
• 关键词: Wilson病; Menkes病; 銅転送ATPase; 活性測定

遺伝子解析からWilson病、Menkes病は銅転送ATPaseの異常であると考えられている。しかし本酵素の活性を検討した報告はない。本研究では本酵素の活性測定法を開発した。材料・方法:正常ヒト、Menkes病患者の培養皮膚線維芽細胞をHoriuchiらの方法で回収しサンプルとした。ATP溶液(1μM)100μlに正常ヒトのサンプル(タンパク量として10〜60μg)、グルタチオン銅(1〜100μM)、ルシフェラーゼ試薬100μlを加え、銅添加によるATPの減少をルシフェラーゼ反応で測定した。添加する銅濃度、サンプル量による変化を検討し、KmおよびVmaxを求め、最も適切な銅濃度とサンプル量を決定した。さらに確立した方法でMenkes病患者サンプルの本酵素活性を測定した。結果・考察:反応液中の銅濃度の変化では、銅濃度が20μMまでは直線的にATPは減少し、それ以上の銅濃度では飽和曲線になった。Lineweavear-BurkdataのプロットからKm=3.85μM,Vmax=10.6nmol/mg protein/minが得られた。サンプル量の変化では、濃度依存性に活性は増加した。これらの結果より、本方法は銅転送ATPaseの活性を測定していると判断できた。さらに活性測定にはサンプル量は12.5μgタンパク量、銅濃度は20μMが最も望ましいと判断された。本方法で測定すると、正常ヒト培養皮膚線維芽細胞の銅転送ATPaseの活性は1397pmol/mg protein/minであった。Menkes病患者の皮膚線維芽細胞を測定すると検出感度以下であり、本方法が銅転送ATPaseの活性を的確に測定していることを裏付ける結果であった。今度正常ヒトやWilson病患者の肝臓での活性測定法も検討する予定である。

Wilson disease, Menkes disease, copper transfer ATPase abnormality. The activity of this enzyme was investigated and reported. In this study, an enzyme activity assay was developed. Materials and Methods: Horiuchi's method of culturing skin line cells from patients with Menkes 'disease and normal subjects was used to investigate the effects of Horiuchi's method. ATP solution (1μM)100μl for normal concentration (10 ~ 60μg), copper (1 ~ 100μM), ATP (1 ~ 100μl), copper (1 ~ 100μM), copper (1 ~ 1 Add copper concentration, copper concentration, To establish a method for determining the activity of this enzyme in Menkes disease patients Results: The copper concentration in the reaction solution changed linearly from 20 μ M to 20 μ M, ATP decreased linearly from 20μM to 20μM, copper concentration increased linearly from 20 μ M to 20 μ M, ATP decreased linearly from 20 μ M to 20 μ M. Lineweavear-Burkdata was obtained with Km=3.85μM,Vmax=10.6nmol/mg protein/min. The concentration dependence of the activity increases. This method can be used to determine the activity of copper transport ATPase. The activity determination was based on the optimal concentration of copper at 12.5μg and 20μM. The activity of Cu ~(2 +)-ATPase in cultured normal skin cells was 1397pmol/mg protein/min. The method can accurately measure the activity of copper transport ATPase in the skin of patients with Menkes disease. The liver activity assay of normal subjects and Wilson disease patients was used to determine the activity of liver tissue.