不死化培養角膜上皮細胞を用いた角膜上皮細胞の細胞増殖と分化の制御メカニズムの解明

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初年度は温度感受性不死化細胞株の培養温度による性状変化に関する基礎的データの収集を行ない、以下の結果を得た。1.不死化株の培養温度による細胞増殖能の差温度感受性不死化細胞株を32℃、37℃、42℃の3条件で組織培養をおこなった。その結果、37℃で細胞増殖は対数曲線を示したのに対し、32℃で細胞増殖は認められず、42℃では一定の増殖の後、プラトー状態となった。2.不死化株の培養温度によるT抗原発現の差上記3条件のうち、細胞の生着を認めた、37℃、42℃の培養温度でT抗原発現を経時的に抗T抗原抗体を用いた免疫組織化学法にて検討をおこなった。その結果、37℃では常に強い染色性を示した。一方、42℃では細胞増殖の停止とともに染色性の低下を認めた。3.不死化株の培養温度による細胞形態の差上記3条件のうち、細胞の生着を認めた、37℃、42℃の培養温度で細胞培養をおこない、位相差顕微鏡、走査型、透過型電子顕微鏡で観察をおこなった。その結果、37℃では均一な敷石状の形態を示し、細胞間の接着機構を有しなかった。一方、42℃では重層化の後、家兎角膜上皮初代継代培養に類似した形態を示した。以上、角膜輪部上皮-幹細胞の分化機構解明のモデルとして、SV40ウイルスの変異株から分離された、温度感受性T抗原遺伝子を角膜輪部上皮細胞に導入した不死化株を作成した。その結果、培養温度を変化させることによりT抗原発現を介し細胞増殖能を制御し、形態学的分化の誘導可能な不死化培養細胞株の作成に成功した。