温度感受性腫瘍抗原遺伝子を用いた不死化角膜輪部上皮細胞株の作成と性状分析

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長期にわたる継代培養が困難とされる角膜上皮細胞の代替として不死化細胞株を作成するため、研究者らはウイルス癌遺伝子の一つであるSV40ウイルスのもつ大型腫瘍抗原(以下、T抗原)遺伝子を角膜上皮細胞内に導入し、不死化培養角膜上皮細胞株の作成に成功した。しかし、その後の研究により細胞の悪性癌化を示す軟寒天内増殖能を有することや、一部の細胞骨格ケラチンの発現がないことなど形質転換が認められるに至った。本研究では、さらに正常角膜上皮細胞に性状の近い不死化株を作成するために前述のSV40ウイルスの突然変異株から分離された、温度感受性T抗原遺伝子の導入を行ない不死化株の性状分析を行なった。温度感受性T抗原遺伝子は温度依存的にT抗原の発現が変化し、野性株由来のT抗原遺伝子と異なり通常の培養温度より高温い非許容温度ではT抗原の発現が認められず、癌遺伝子としての機能が不活化されることから、培養温度を変化させることで不死化を制御することが可能である。今回、本遺伝子を導入した不死化株では1)37℃ではconfluent状態においても高い増殖能を示すが、42℃ではconfluent状態において重層化した細胞は増殖せず、正常角膜上皮細胞に類似した増殖曲線を示した。2)各々の抗体を用いた免疫蛍光染色において角膜上皮細胞特有の細胞骨格ケラチンは42℃でより多く発現する一方、T抗原発現は37℃では常に発現が認められたが、42℃では増殖能の低下にともない経時的に減少した。3)位相差顕微鏡および走査型、透過型電子顕微鏡を用いた観察で42℃で培養した細胞は正常角膜上皮細胞に類似した形態を示した。これらの結果、この温度感受性不死化株は非許容温度ではより正常角膜上皮細胞に類似した性状を保持していると考えられ、培養角膜上皮細胞の代替として細胞生物学的研究に有用であると考えられた。