高度好熱菌の遺伝子操作系の開発と酵素の進化工学的耐熱化に関する研究

高嗜热细菌基因工程系统的开发以及通过酶的进化工程研究热稳定性

• 批准号: 09780552
• 负责人: 玉腰 雅忠
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Tokyo University of Pharmacy and Life Science
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1997
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1997 至 1998
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09780552/
• 关键词: 高度好熱菌; Thermus thermophilus; 宿主ベクター系; 進化分子工学; 3-イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ; 耐熱化; 宿主・ベクター系; 進化工学; イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ

ロイシン合成に関わるleuB遺伝子をマーカーとする高度好熱菌Thermus thermophilusの宿主・ベクター系を開発するにあたり、ロイシン合成系オペコンの構造解析を行った。その結果leuC-leuD-leuB遺伝子の順に遺伝子が並んでおり、leuD遺伝子の終止コドンとleuB遺伝子の開始コドンが重なっていることがわかった。次にピリミジン合成系に関わるpyrE遺伝子マーカーとした2回の相同組換えによりleuB遺伝子のみを欠失する宿主の作製を行った。その株を宿主として大腸菌および酵母イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ(IPMDH)を発現させるためのベクターを開発した。IPMDHはロイシン合成に関わる酵素であり、常温生物のIPMDHを発現するT.thermophilusはロイシンのない培地では高い温度で生育できない。そこで、突然変異により高温下で生育できるようになったなった好熱菌は耐熱化したIPMDHを発現している可能性がある。酵母IPMDHを発現するT.thermophilusはロイシンのない培地で50℃までしか生育できなかったが、その株を培養温度を徐々に上げて60、62、65、67および70℃でも生育可能となった株を順に選択したところ、IPMDHに一つずつの変異が加わっていることがわかった。このうち、70℃で生育できるようになった好熱菌の産生する変異IPMDHと酵母の野生型IPMDHを精製して耐熱性を調べたところ、変異酵素は野生型酵素よりも約10℃耐熱化していた。また野生型酵素は緩衝液中にグリセロールがないと急速に失活するが、変異酵素はそのような安定化剤がなくても失活しないことがわかり、耐熱性だけでなく広い意味での安定性が向上した酵素を得ることができた。

The structural analysis of the host of Thermus thermophilus was carried out in the development of the synthetic system. As a result, leuC-leuD-leuB genes are combined with each other, and leuD genes are terminated and leuB genes are started. The second part of the synthesis system is related to the same composition of the pyrE gene and the host gene. The host of the plant is Escherichia coli and yeast. IPMDH is an enzyme involved in the synthesis of IPMDH. IPMDH is produced at room temperature. The possibility of heat resistant IPMDH appearing in bacteria is discussed. Yeast IPMDH development T.thermophilus can be cultivated at 50℃, 62 ℃, 65 ℃, 67 ℃ and 70℃. The production of heat resistant bacteria, such as IPMDH and yeast wild-type IPMDH, is regulated by heat resistance, such as heat resistant enzymes, such as IPMDH and yeast wild-type enzymes. The wild-type enzyme is rapidly inactivated in buffer solution, and the enzyme is stabilized by heat resistance, which means that the stability of the enzyme is increased.

项目成果

Masatada,Tamakoshi: "An efficient gene replacement and deletion system for an extreme thermophile,Thermus thermophilus" FEMS Microbiology Letters. (印刷中). (1999)

Masatada, Tamakoshi：“一种针对极端嗜热菌的高效基因替换和删除系统”FEMS 微生物学快报（1999 年出版）。

Masatada Tamakoshi: "The organization of the lenC,lenD and lenB genes of the extreme thermophile Thermus thermophilus" Gene. 222. 125-132 (1998)

Masatada Tamakoshi：“极端嗜热栖热菌的 lenC、lenD 和 lenB 基因的组织”基因。

Masatada Tamakoshi: "A New Thermus-Escherichia coli Shuttle Integration Vector System" Journal of Bacteriology. 179. 4811-4814 (1997)

Masatada Tamakoshi：“一种新的栖热菌-大肠杆菌穿梭整合载体系统”细菌学杂志。