高度好熱菌の遺伝子操作系の開発と酵素の進化工学的耐熱化に関する研究

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ロイシン合成に関わるleuB遺伝子をマーカーとする高度好熱菌Thermus thermophilusの宿主・ベクター系を開発するにあたり、ロイシン合成系オペコンの構造解析を行った。その結果leuC-leuD-leuB遺伝子の順に遺伝子が並んでおり、leuD遺伝子の終止コドンとleuB遺伝子の開始コドンが重なっていることがわかった。次にピリミジン合成系に関わるpyrE遺伝子マーカーとした2回の相同組換えによりleuB遺伝子のみを欠失する宿主の作製を行った。その株を宿主として大腸菌および酵母イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ(IPMDH)を発現させるためのベクターを開発した。IPMDHはロイシン合成に関わる酵素であり、常温生物のIPMDHを発現するT.thermophilusはロイシンのない培地では高い温度で生育できない。そこで、突然変異により高温下で生育できるようになったなった好熱菌は耐熱化したIPMDHを発現している可能性がある。酵母IPMDHを発現するT.thermophilusはロイシンのない培地で50℃までしか生育できなかったが、その株を培養温度を徐々に上げて60、62、65、67および70℃でも生育可能となった株を順に選択したところ、IPMDHに一つずつの変異が加わっていることがわかった。このうち、70℃で生育できるようになった好熱菌の産生する変異IPMDHと酵母の野生型IPMDHを精製して耐熱性を調べたところ、変異酵素は野生型酵素よりも約10℃耐熱化していた。また野生型酵素は緩衝液中にグリセロールがないと急速に失活するが、変異酵素はそのような安定化剤がなくても失活しないことがわかり、耐熱性だけでなく広い意味での安定性が向上した酵素を得ることができた。