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進化分子工学を用いた蛋白質のフォールディング機構に関する研究

利用进化分子工程研究蛋白质折叠机制

基本信息

批准号：
13780486
负责人：
玉腰雅忠
金额：
$ 1.41万
依托单位：
Tokyo University of Pharmacy and Life Science
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至 2002
项目状态：
已结题

项目摘要

大腸菌3-イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ(IPMDH)を好熱菌IPMDHの代わりに好熱菌内で発現させると、高温では凝集体を形成するために56度以上では生育できない。しかし、56度でも生育可能となった好熱菌を突然変異により選択したところ、IPMDH遺伝子内にS106Iの変異が起きていた。その変異酵素は野生型大腸菌IPMDHと比べて耐熱性や触媒活性が低下していたものの、変性状態から希釈によるリフォールディングする能力が向上していた。この反応において濁度を測定したところ、濁度上昇が抑制された事から、S106I変異によりフォールディング過程における凝集体形成が抑制される事がわかった。本酵素は野生型酵素の結晶構造解析から、ホモダイマー構造のうち一つのサブユニットが大きく2つのドメインに分けられことがわかっている。そして片方のドメイン内にN、C両末端を含むため、フォールディング過程において複雑なトポロジー形成を必要とする。S106部位は、そのドメイン間の中間にあるヒンジ領域にあるが、この部位が置き換わる事により2つの末端を含むドメイン形成が容易になると考察される。また、上記と同じ進化実験系によりS106I+M264Vの二重変異体が得られていた。このうち、M264Vの変異体を人為的に作製し、好熱菌内で発現させたところ、高温での生育はできなかった。したがってM264V変異は単独では凝集体形成の抑制には効果がなく、触媒活性や安定性に関わるものと考えられる。

Coliform 3-free bacteria IPMDH generation is a good thermal bacteria IPMDH generation is a good thermal bacteria in the development of high temperature, high temperature condensation of the formation of high temperature above 56 degrees. 56 ° C. The temperature of the bacteria is different. The temperature of the bacteria is different. The temperature of the bacteria is different. The activity of these enzymes is lower than that of wild-type E. coli IPMDH, and the activity of these enzymes is higher than that of wild-type E. coli IPMDH The turbidity of the sample was measured and the increase of turbidity was inhibited. The aggregation of the sample was inhibited by S106. This enzyme is similar to the wild-type enzyme in crystal structure analysis. The N and C terminals in the film are necessary for the formation of complex molecules in the film. S106: The middle part of S106 is easy to be inspected. S106I + M264V is the same type of evolution as S106I + M264V. M264V is artificially controlled. It is easy to develop in hot bacteria. It is easy to develop in high temperature. M264V is a unique inhibitor of condensation formation, catalyst activity and stability.