遺伝子導入系を用いたボツリヌス菌神経毒素産生調節機構の解析

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ボツリヌス神経毒素の産生調節機構を調べる目的で、以下の実験を行った。1.神経毒素遺伝子領域の構造の決定:ボツリヌスE型菌の神経毒素産生に関わる遺伝子領域を特定するために神経毒素遺伝子周辺の塩基配列を決定し、神経毒素を産生する菌株間での比較を行った。この結果、神経毒素構成成分の遺伝子領域の上流に、毒素産生菌株間で保存された3つの遺伝子からなる遺伝子領域が存在し、また下流にはABCトランスポータのファミリーに属する遺伝子が存在していることが明らかになった。上流、下流の両遺伝子クラスター共に、神経毒素構成成分遺伝子と逆方向で存在していた。また、ABCトランスポータファミリーの遺伝子は、他の型の菌株では保存されていなかったが、上流の3遺伝子は、A型菌など他の菌株でも神経毒素構成成分遺伝子のすぐ近傍に存在していた。2.ボツリヌス菌株の薬剤耐性試験:遺伝子導入の予備実験として、選択マーカーとしてマクロライド耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子の使用が可能かどうか調べたところ、日本で分離されたボツリヌスE型菌株には、クロラムフェニコールは有効であったが、多くがマクロライド耐性形質を獲得していた。3.p47、orfX_1への相同組換えによる変異導入のためのベクター構築:菌体外に放出される神経毒素の構成成分の遺伝子と、同一方向に隣接して存在しているORFである、p47遺伝子及び、E型菌株ではそのすぐ上流に位置するorfX_1遺伝子のノックアウト株を作製するために、これらの遺伝子をcatP遺伝子(クロラムフェニコール耐性遺伝子)に相同組換えより置き換えるためのベクターを作製した。このベクターは、ボツリヌス菌体内で複製されないため、これをエレクトロポレーション法によりボツリヌスE型菌に導入し、クロラムフェニコールに耐性化した菌株を選別して神経毒素遺伝子の転写量の変化及び、神経毒素産生を調べることにより、これらの遺伝子がどのように毒素産生に関わるのか明らかにすることができるとおもわれる。