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シナプス小胞の膜融合とそのクロストリジウム神経毒素による阻害機構の解析

突触小泡膜融合及其梭菌神经毒素抑制机制分析

基本信息

批准号：
08670304
负责人：
林哲也
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Shinshu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-08670304/
关键词：
クロストリジウム神経毒シナプス小胞膜融合 SNARE SNAP NSF

项目摘要

(1)His6-融合蛋白質としてF型ボツリヌス毒素を除くすべてのクロストリヂウム神経毒軽鎖を調整する必要があったが、C型とG型毒素については大腸菌での産生量に問題があるためNiカラムのみでは十分な純度が得られなかった。そこで種々の精製法を試みた結果、MonoSカラムを用いることにより90%以上の純度を持つ標品が得られた。この標品を用いてC型毒素のSNAP-25切断部位の同定に成功した(投稿準備中)。(2)SNARE複合体の形成と解離を解析する過程で、α-あるいはβ-SNAPとは対照的に、これまでまったく検討されてこなかったγ-SNAPの複合体への結合をリコンビナントのSNARE蛋白質とα、βおよびγ-SNAPを用いたin vitroの結合実験で解析した結果、γ-SNAPはα-あるいはβ-SNAPがSNARE複合体に結合して初めて複合体に結合ができること、さらにその結合によりNSFによるSNARE複合体の解離が促進されることが明らかとなった。γ-SNAPのみが存在する条件下ではこの解離が起きないことから、γ-SNAP自身にはNSFによるSNARE複合体の解離を引き起こす能力はなく、むしろα-あるいはβ-SNAPの作用を促進する機能を持つことが示された。またこのγ-SNAPの複合体への結合においてはSNAP-25の存在が重要であること、その際、SNAP-25のN末端半分とC末端半分の各領域は独立したドメインとして機能することが明らかとなった(投稿準備中)。(3)SNARE蛋白質あるいはSNARE複合体のリポゾーム上えの再構築を試みたが、現在のところ膜融合実験に十分なだけの性状をもつリポゾームの作成には成功していない。今後脂質の組成とリポゾームの作成条件をさらに検討する必要がある。

(1)His6-fusion protein is essential for the regulation of the neurotoxin lock in the production of E. coli, type C and type G toxins, and for the elimination of F-type toxins. The purity of the product is more than 90%. The identification of SNAP-25 cleavage site using this standard was successful (preparation for submission). (2)SNARE complex formation and dissociation process, α-SNAP, β-SNAP, γ-SNAP complex binding, α-SNAP, β-SNAP, γ-SNAP, α-SNAP, γ-SNAP, α-SNAP, β-SNAP, γ-SNAP, α-SNAP, γ-SNAP, α-SNAP, γ-SNAP, γ-SNARE, α-SNAP, γ-SNARE, γ-SNARE, γ-SNARE, α-SNAP, γ-SNAP, γ-SNARE, γ-SNARE, γ-SNARE, α-SNAP, γ-SNAP, γ-SNARE, γ-SNAP, γ-SNARE, γ-SNARE, γ-SNAP, γ-SNARE, γ-SNARE, γ-SNAP, γ-SNARE, γ-The dissociation of SNARE complexes is promoted by the combination of NSF and SNARE. If the core of γ-SNAP exists, its dissociation cannot occur. The ability of γ-SNAP itself to initiate the dissociation of the SNARE complex in the NSF and the function of α-SNAP to promote the role of β-SNAP have been demonstrated. The binding of γ-SNAP complex is important for the existence of SNAP-25. The N-terminal half and C-terminal half of SNAP-25 are independent of each other in their respective fields. (3)SNARE protein is successfully constructed from SNARE complex. In the future, it is necessary to discuss the preparation conditions of lipid composition and lipid composition.