シナプス小胞の膜融合とそのクロストリジウム神経毒素による阻害機構の解析

突触小泡膜融合及其梭菌神经毒素抑制机制分析

• 批准号: 08670304
• 负责人: 林 哲也
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: Shinshu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-08670304/
• 关键词: クロストリジウム神経毒; シナプス小胞; 膜融合; SNARE; SNAP; NSF

(1)His6-融合蛋白質としてF型ボツリヌス毒素を除くすべてのクロストリヂウム神経毒軽鎖を調整する必要があったが、C型とG型毒素については大腸菌での産生量に問題があるためNiカラムのみでは十分な純度が得られなかった。そこで種々の精製法を試みた結果、MonoSカラムを用いることにより90%以上の純度を持つ標品が得られた。この標品を用いてC型毒素のSNAP-25切断部位の同定に成功した(投稿準備中)。(2)SNARE複合体の形成と解離を解析する過程で、α-あるいはβ-SNAPとは対照的に、これまでまったく検討されてこなかったγ-SNAPの複合体への結合をリコンビナントのSNARE蛋白質とα、βおよびγ-SNAPを用いたin vitroの結合実験で解析した結果、γ-SNAPはα-あるいはβ-SNAPがSNARE複合体に結合して初めて複合体に結合ができること、さらにその結合によりNSFによるSNARE複合体の解離が促進されることが明らかとなった。γ-SNAPのみが存在する条件下ではこの解離が起きないことから、γ-SNAP自身にはNSFによるSNARE複合体の解離を引き起こす能力はなく、むしろα-あるいはβ-SNAPの作用を促進する機能を持つことが示された。またこのγ-SNAPの複合体への結合においてはSNAP-25の存在が重要であること、その際、SNAP-25のN末端半分とC末端半分の各領域は独立したドメインとして機能することが明らかとなった(投稿準備中)。(3)SNARE蛋白質あるいはSNARE複合体のリポゾーム上えの再構築を試みたが、現在のところ膜融合実験に十分なだけの性状をもつリポゾームの作成には成功していない。今後脂質の組成とリポゾームの作成条件をさらに検討する必要がある。

（1）除了F型肉毒杆菌毒素作为HIS6融合蛋白外，必须调整所有神经毒素光链，但由于C和G-type毒素在大肠杆菌中的产生量的问题，因此无法单独使用NI柱单独获得足够的纯度。因此，尝试了各种纯化方法，并使用单声道柱，获得了90％或更多的制剂。使用此准备工作，我们成功地确定了C型毒素的Snap-25裂解的位点（用于发布）。 （2）在分析与α-或β-SNAP相反的SNARE复合物的形成和解离的过程中，γ-SNAP与以前没有研究过的γ-SNAP与该复合物的结合，在使用重组蛋白和α，β，β和γ-SNAP的复合物中分析了体外结合实验。 β-SNAP结合了SNARE复合物，并且这种结合促进了NSF的SNARE复合物的解离。在仅存在γ-SNAP的条件下，这种解离并不发生，并且已经表明，γ-SNAP本身没有NSF引起SNARE复合物解离的能力，而是具有促进α-或β-SNAP的作用的功能。此外，揭示了SNAP-25的存在对于与该γ-SNAP复合物的结合至关重要，并且SNAP-25的N末端半末端和C末端一半充当独立域（以准备发布）。 （3）我们试图重建SNARE蛋白或SNARE复合物的脂质体叠加层，但是目前，我们还没有成功地创建具有足够特性的膜融合实验的脂质体。有必要进一步研究脂质组成和未来制备脂质体的条件。