シナプス小胞の膜融合とそのクロストリジウム神経毒素による阻害機構の解析

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(1)His6-融合蛋白質としてF型ボツリヌス毒素を除くすべてのクロストリヂウム神経毒軽鎖を調整する必要があったが、C型とG型毒素については大腸菌での産生量に問題があるためNiカラムのみでは十分な純度が得られなかった。そこで種々の精製法を試みた結果、MonoSカラムを用いることにより90%以上の純度を持つ標品が得られた。この標品を用いてC型毒素のSNAP-25切断部位の同定に成功した(投稿準備中)。(2)SNARE複合体の形成と解離を解析する過程で、α-あるいはβ-SNAPとは対照的に、これまでまったく検討されてこなかったγ-SNAPの複合体への結合をリコンビナントのSNARE蛋白質とα、βおよびγ-SNAPを用いたin vitroの結合実験で解析した結果、γ-SNAPはα-あるいはβ-SNAPがSNARE複合体に結合して初めて複合体に結合ができること、さらにその結合によりNSFによるSNARE複合体の解離が促進されることが明らかとなった。γ-SNAPのみが存在する条件下ではこの解離が起きないことから、γ-SNAP自身にはNSFによるSNARE複合体の解離を引き起こす能力はなく、むしろα-あるいはβ-SNAPの作用を促進する機能を持つことが示された。またこのγ-SNAPの複合体への結合においてはSNAP-25の存在が重要であること、その際、SNAP-25のN末端半分とC末端半分の各領域は独立したドメインとして機能することが明らかとなった(投稿準備中)。(3)SNARE蛋白質あるいはSNARE複合体のリポゾーム上えの再構築を試みたが、現在のところ膜融合実験に十分なだけの性状をもつリポゾームの作成には成功していない。今後脂質の組成とリポゾームの作成条件をさらに検討する必要がある。