大腸菌異物排出タンパク質の高次構造の解明

阐明大肠杆菌异生物质排泄蛋白的高级结构

• 批准号: 10771289
• 负责人: 染谷 雄一
• 金额: $ 1.22万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1998
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1998 至 1999
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-10771289/
• 关键词: 異物排出タンパク質; テトラサイクリン; テトラサイクリン排出タンパク質; 二次性性能動輸送体; 結晶化; 一次性能動輸送体; P-糖タンパク質; 融合タンパク質

生体異物排出タンパク質はすべての生物に見いだされている。本研究では、異物排出タンパク質の三次元立体構造の解明を目指し、以下の実験を行った。二次性能動輸送体の構造解明を目指し、大腸菌のテトラサイクリン排出タンパク質TetAを選択した。TetAは、抗生物質であるテトラサイクリンを細胞外に排出している。TetAを簡便にかつ大量に精製するために、TetAのC末端にHistidine-tagが付加するように改変したtetA遺伝子をlacプロモータ支配下に作成した。目的タンパク質が大量発現した大腸菌の膜画分を界面活性剤を用いて可溶化し、TetAをニッケルアフィニティレジンで精製した。精製TetAから三次元結晶を得るために、結晶化スクリーニングキットを用いてシッティングドロップ蒸気拡散法で結晶化条件の検索を行った。150種の条件の中から4つの条件でTetAの微結晶を得ることができた。今後は、条件を詳細に検討し、良質の結晶を得ることを目指す。また、これまで結晶化されている膜タンパク質が比較的親水性部分に富んでいることに着目し、TetAのN末端あるいはC末端に親水性タンパク質を融合させた。親水性タンパク質は、ジヒドロ葉酸還元酵素、β-ラクタマーゼ、クロラムフェニコールアセチル転移酵素、グルタチオン-S-転移酵素を選択した。融合遺伝子をlacプロモータ支配下に作成した。いずれの融合タンパク質も大腸菌膜画分に大量発現したが、現在のところ、比較的高い活性を保持するジヒドロ葉酸還元酵素融合タンパク質をメトトレキセートレジンで精製し、結晶化条件を検討している。一次性能動輸送体の代表として、哺乳動物のP-糖タンパク質に類似した大腸菌のMdlABタンパク質を選び、その発現系の構築に成功した。今後、大量に精製し、結晶化条件を検討する。

The excretion of foreign bodies in organisms is タ, <s:1>, パ, <s:1>, すべて, に. In this study, で で, foreign body excretion タ, パ パ, three-dimensional structure of the molar <s:1>, <s:1>, clarification を, and the following microscopic experiments を are conducted った. The <s:1> structure of the secondary performance dynamic carrier is explained. Youdaoplaceholder0 the objective is to point to テトラサ, escherichia coli テトラサ テトラサ <s:1> リ <s:1> <s:1> <s:1> <s:1> <s:1> <s:1> <s:1> <s:1> <s:1> テトラサ excrete タ タ パ パ TetAを select 択 た た. TetA, antibiotics であるテトラサ であるテトラサ リ リ リ を を を are excreted extracellular に, and <s:1> て る る る. Simple TetA を に か つ large に refined す る た め に, TetA の C terminal に Histidine - tag が plus す る よ う に change - し た TetA heritage 伝 son を lac プ ロ モ ー タ domination に done し た. Purpose タ ン パ ク qualitative が large 発 now し た coliform の draw points を interface active tonic を い て solubilization し, TetA を ニ ッ ケ ル ア フ ィ ニ テ ィ レ ジ ン で refined し た. Refined TetA か ら three dimensional crystallization を る た め に, crystallization ス ク リ ー ニ ン グ キ ッ ト を with い て シ ッ テ ィ ン グ ド ロ ッ プ steamed 気 company, scattered method で crystallization conditions の 検 cable line を っ た. Among the 150 <s:1> conditions <e:1>, the る ら4 <s:1> condition でTetA <s:1> microcrystallization を obtained る <s:1> とがで た た た た た た た た. In the future, <s:1>, conditions を will be detailed. Youdaoplaceholder1 will be discussed for す, and high-quality <s:1> crystals を will be obtained for る を とを and とを. ま た, こ れ ま で crystallization さ れ て い る membrane タ ン パ ク qualitative が compare hydrophilic part に rich ん で い る こ と に mesh し, TetA の N terminal あ る い は C terminal に hydrophilic タ ン パ ク qualitative を fusion さ せ た. Hydrophilic タ ン パ ク は, ジ ヒ ド ロ folic acid also yuan enzyme, beta ラ ク タ マ ー ゼ, ク ロ ラ ム フ ェ ニ コ ー ル ア セ チ ル planning shift enzyme, グ ル タ チ オ ン - S - planning shift enzyme を sentaku し た. Under the domination of the 伝 subunit をlacプロモ 伝 タ タ, に is made as た た. い ず れ の fusion タ ン パ ク qualitative も coliform membrane points に much 発 now し た が, now の と こ ろ, comparison of high い activity を keep す る ジ ヒ ド ロ folic acid also yuan enzyme blend タ ン パ ク qualitative を メ ト ト レ キ セ ー ト レ ジ ン で refined し, crystallization conditions を beg し 検 て い る. One-time active transport body の representative と し て, mammals の P - sugar タ ン パ ク qualitative に similar し た coliform の MdlAB タ ン パ ク を choose び, そ の 発 built now is の に success し た. In the future, a large amount of に refining に and crystallization conditions を検 are discussed for する.