大腸菌異物排出タンパク質の高次構造の解明

生体異物排出タンパク質はすべての生物に見いだされている。本研究では、異物排出タンパク質の三次元立体構造の解明を目指し、以下の実験を行った。二次性能動輸送体の構造解明を目指し、大腸菌のテトラサイクリン排出タンパク質TetAを選択した。TetAは、抗生物質であるテトラサイクリンを細胞外に排出している。TetAを簡便にかつ大量に精製するために、TetAのC末端にHistidine-tagが付加するように改変したtetA遺伝子をlacプロモータ支配下に作成した。目的タンパク質が大量発現した大腸菌の膜画分を界面活性剤を用いて可溶化し、TetAをニッケルアフィニティレジンで精製した。精製TetAから三次元結晶を得るために、結晶化スクリーニングキットを用いてシッティングドロップ蒸気拡散法で結晶化条件の検索を行った。150種の条件の中から4つの条件でTetAの微結晶を得ることができた。今後は、条件を詳細に検討し、良質の結晶を得ることを目指す。また、これまで結晶化されている膜タンパク質が比較的親水性部分に富んでいることに着目し、TetAのN末端あるいはC末端に親水性タンパク質を融合させた。親水性タンパク質は、ジヒドロ葉酸還元酵素、β-ラクタマーゼ、クロラムフェニコールアセチル転移酵素、グルタチオン-S-転移酵素を選択した。融合遺伝子をlacプロモータ支配下に作成した。いずれの融合タンパク質も大腸菌膜画分に大量発現したが、現在のところ、比較的高い活性を保持するジヒドロ葉酸還元酵素融合タンパク質をメトトレキセートレジンで精製し、結晶化条件を検討している。一次性能動輸送体の代表として、哺乳動物のP-糖タンパク質に類似した大腸菌のMdlABタンパク質を選び、その発現系の構築に成功した。今後、大量に精製し、結晶化条件を検討する。

生体異物排出タンパク質はすべての生物に見いだされている。本研究では、異物排出タンパク質の三次元立体構造の解明を目指し、以下の実験を行った。二次性能動輸送体の構造解明を目指し、大腸菌のテトラサイクリン排出タンパク質TetAを選択した。TetAは、抗生物質であるテトラサイクリンを細胞外に排出している。TetAを簡便にかつ大量に精製するために、TetAのC末端にHistidine-tagが付加するように改変したtetA遺伝子をlacプロモータ支配下に作成した。目的タンパク質が大量発現した大腸菌の膜画分を界面活性剤を用いて可溶化し、TetAをニッケルアフィニティレジンで精製した。精製TetAから三次元結晶を得るために、結晶化スクリーニングキットを用いてシッティングドロップ蒸気拡散法で結晶化条件の検索を行った。150種の条件の中から4つの条件でTetAの微結晶を得ることができた。今後は、条件を詳細に検討し、良質の結晶を得ることを目指す。また、これまで結晶化されている膜タンパク質が比較的親水性部分に富んでいることに着目し、TetAのN末端あるいはC末端に親水性タンパク質を融合させた。親水性タンパク質は、ジヒドロ葉酸還元酵素、β-ラクタマーゼ、クロラムフェニコールアセチル転移酵素、グルタチオン-S-転移酵素を選択した。融合遺伝子をlacプロモータ支配下に作成した。いずれの融合タンパク質も大腸菌膜画分に大量発現したが、現在のところ、比較的高い活性を保持するジヒドロ葉酸還元酵素融合タンパク質をメトトレキセートレジンで精製し、結晶化条件を検討している。一次性能動輸送体の代表として、哺乳動物のP-糖タンパク質に類似した大腸菌のMdlABタンパク質を選び、その発現系の構築に成功した。今後、大量に精製し、結晶化条件を検討する。