权益分类	功能权益	普通用户	{{item.name}}会员
{{category.name}}	{{benefitItem.name}}

新規α-アミラーゼTVA IIのX線結晶構造解析に基づく活性機構の解明

基于X射线晶体结构分析阐明新型α-淀粉酶TVA II的活性机制

基本信息

批准号：
10780362
负责人：
神鳥成弘
金额：
$ 1.22万
依托单位：
Tokyo University of Agriculture and Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1998
资助国家：
日本
起止时间：
1998 至 1999
项目状态：
已结题

项目摘要

好熱性放線菌(Thermoactinomyces vulgaris R-47)は、2つのα-アミラーゼ(TVA1,TVA2)を持つ。これらは、デンプンに加えて、通常のα-アミラーゼがほとんど加水分解できない環境オリゴ糖であるシクロデキストリンやα-1,4、α-1,4、α-1,6が規則正しく繰り返す多糖であるプルランも分解できるという興味深い基質特異性を持つ。平成10年度においては、低温下(100K)でデータ収集を行い、TVA2の3次元構造をX線結晶解析により明らかにした(Kamitori et al.(1999)J.Mol.Biol.287,907-921)。その結果,TVA2は、通常のα-アミラーゼが持っていない120残基からなる新たなドメイン(Domain N)をN末側に持つこと、シクロデキストリンを認識できると考えられるPhe286残基を活性部位付近に持つこと、TVA2の活性部位は他のα-アミラーゼに比べて浅くプルランを認識するのに都合がよいことが明らかになった。平成11年度は、TVA2がどのように基質を認識するかを明らかにするために、触媒活性残基であるGluをAlaに置換したミュータント酵素(E354A)を合成し、数々の基質との複合体の結晶作製を試みた。その結果、E354とβ-シクロデキストリン(β-CD)との複合体のX線データを放射光(SPring-8)を用いて収集することに成功し、解析をすすめている。現在、構造は、2.8Å分解能、R-factor=0.22まで精密化を行い、シクロデキストリンに対応する電子密度もはっきりと得られている。Phe286はシクロデキストリンと相互作用しており、酵素に対する基質の相対的な配向・位置を決定できている。以上の結果をふまえ、Phe286がシクロデキストリン認識において果たしている役割をさらに明確にするため、Phe286を様々な大きさのアミノ酸残基(Ala、Leu、Tyr、Trp)に置換したミュータント酵素を合成し、反応パラメータの測定・X線結晶解析をすすめている。

Thermoactinomyces vulgaris R-47) and 2つのα-アミラーゼ(TVA1, TVA2).これらは、デンプンに加えて、usually のα-アミラーゼがほとんどAdd water to decompose it -1,4, α-1,4, α-1,6, the rules are positive and the polysaccharide is decomposed and the substrate is specific. Heisei 10 においては, low temperature (100K) collection を行い, TVA2's 3-dimensional structure をX-ray crystal analysis により明らかにした(Kamitori et al. (1999) J. Mol. Biol. 287, 907-921).そのRESULTS, TVA2は, usually のα-アミラーゼがhold っていない120 residue からなる新たなドメイン(Domain N) をN terminal side にhold つこと, シクロデキストリンを recognized できるとtest えられるPhe286 residue をactive site close にhold つこと, the active site of TVA2 is はα-アミラーゼに比べて shallow くプルランをknow するのに都合がよいことが明らかになった. Heisei 11 year は, TVA2 がどのようにsubstrate するかを明らかにするために, catalytic active residue であるGlu The Ala-replacement enzyme (E354A) was synthesized, and the number of substrates and complexes was crystallized and tested.その results, E354 and β-シクロデキストリン (β-CD) and との complex のX-ray データをEmission light (SPring-8)をUse いて to collect することに successfully and analyze をすすめている. Now, structure は, 2.8Å resolution energy, R-factor=0.22, precision を行い, シクロデキストリンに対応するelectron density もはっきりと得られている. Phe286 is a chemical that interacts with each other, and the alignment and position of the enzyme and matrix are determined by the interaction. The above results show that Phe286 has achieved success Phe286を様々な大きさのThe synthesis of amino acid residues (Ala, Leu, Tyr, Trp) and the substitution of したミュータントzyme are as follows, and the determination and X-ray crystallization analysis of をすすめている.