ムスカリン性アセチルコリン受容体の2次元結晶化

SF9/バキュウロウィルス系で発現させたムスカリン性アセチルコリン性受容体M_2サブタイプの二次元結晶化を試みている。昨年度の研究で、界面活性剤にアルキルマルトシドを用い、精製を行うことで受容体をリポソームに効率よく組み込めることが分かった。だが、受容体をアルキルマルトシドで直接可溶化した場合には、その安定性に問題がある場合が多かった。そこで、再び精製法の検討を行うことにした。可溶化の際にアンタゴニストであるQuinuclidinyl benzilate(QNB)を予め結合させておくと数週間にわたり受容体が安定であることが分かった。だが、この条件だと受容体にアンタゴニストが結合しているため、精製に最も効果を発揮するリガンドカラム(ABTアガロース)を用いることができない。検討の結果、以下の条件が最適であることが分かった。デシルマルトシドで可溶化したQNB-受容体複合体を(1)S.P.-セファロース(2)Co^<2+>キレーティング・セファロース(3)リソースSの順に精製し可溶化時の約60%の回収率でSDS-PAGE上で精製度がほぼ均一なサンプルを得ることができた。また、脂質への再構成の際、脂質:蛋白の重量比を2次元結晶化に理想的な値である1:1で行ったところ、電子顕微鏡で、直径約0.4μmのプロテオリポソームを観察することができた。現在はこの新しい精製法で得られた受容体を用い、2次元結晶化へ向けて、溶液等の条件検討を行っている段階である。

SF9/バキュウロウィルス系で発現させたムスカリン性アセチルコリン性受容体M_2サブタイプの二次元結晶化を試みている。昨年度の研究で、界面活性剤にアルキルマルトシドを用い、精製を行うことで受容体をリポソームに効率よく組み込めることが分かった。だが、受容体をアルキルマルトシドで直接可溶化した場合には、その安定性に問題がある場合が多かった。そこで、再び精製法の検討を行うことにした。可溶化の際にアンタゴニストであるQuinuclidinyl benzilate(QNB)を予め結合させておくと数週間にわたり受容体が安定であることが分かった。だが、この条件だと受容体にアンタゴニストが結合しているため、精製に最も効果を発揮するリガンドカラム(ABTアガロース)を用いることができない。検討の結果、以下の条件が最適であることが分かった。デシルマルトシドで可溶化したQNB-受容体複合体を(1)S.P.-セファロース(2)Co^<2+>キレーティング・セファロース(3)リソースSの順に精製し可溶化時の約60%の回収率でSDS-PAGE上で精製度がほぼ均一なサンプルを得ることができた。また、脂質への再構成の際、脂質:蛋白の重量比を2次元結晶化に理想的な値である1:1で行ったところ、電子顕微鏡で、直径約0.4μmのプロテオリポソームを観察することができた。現在はこの新しい精製法で得られた受容体を用い、2次元結晶化へ向けて、溶液等の条件検討を行っている段階である。