イオン能動輸送のメカニズム解明へ向けた立体構造解析

三维结构分析阐明活性离子传输机制

• 批准号: 13780523
• 负责人: 小川 治夫
• 金额: $ 1.79万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 2002
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13780523/
• 关键词: P-type ATPase; ion pump; active transport; x-ray crystallography

(1)超高度好熱菌であるMethanococcus jannaschii由来の水溶性P-type ATPaseであるMJ0968の結晶化を試みている。蛋白質の結晶化の為には、サンプルの安定供給が必須である。そのため、精製系の工夫を行った。超高度好熱菌由来の蛋白質は熱に対し耐性があることは良く知られている。また、これら菌由来の蛋白質を大腸菌等で大量発現し精製を行う際、前処理として回収した大腸菌自身を100℃前後で熱し、他の蛋白質を変性させ、精製の簡便化を行う方法は一般的である。そこで、この手法をMJ0968の精製系に組み込んだ。回収した大腸菌は液体窒素で凍らせ、また液体窒素中で粉末に処理した。その結果、回収した大腸菌に熱が均等に行き渡るようになった。C末に6Hisを修飾している関係上、熱処理後はヒスチジンカラムでの1ステップで精製を行えるため、これまで以上に簡便かつ大量に精製サンプルを得る事のできる方法を確立したと言える。現在、この方法で精製を行ったサンプルを用い、結晶化を行っている最中である。(2)シアノバクテリア由来の1)P-type ATPaseの大量発現を試みている。シアノバクテリアPCC6803株を入手し、genomic DNAを単離精製の後、4種類のATPase遺伝子をPCRでサブクローニングした。その後、これら遺伝子を大腸菌用の発現ベクターに組み込み、大腸菌による大量発現を試みたが、大量の発現蛋白質を得るに至っていない。今後、発現系の改良を行い、改善を図る予定である。

(1)Methanococcus jannaschii is a water-soluble enzyme that crystallizes in MJ0968. Protein crystallization is necessary for stable supply.そのため、精制系の工夫を行った。The origin of super-high-temperature bacteria is heat resistance. A large amount of proteins derived from bacteria, such as Escherichia coli, are produced during purification, pretreatment, and recycling. Escherichia coli itself is heated around 100℃, and other proteins are changed. The purification method is simple. MJ0968 is a refined system. In addition, the preparation method of Escherichia coli liquid and powder can be used. The result is that the E. coli is hot and cold. C end 6His modification on the relationship, after heat treatment, the first step of refining, the above simple, a large number of refining, the first step of the method to establish Now, the method of refining, crystallization, etc. (2)1) The large amount of P-type ATPase appeared in the middle of the experiment. The genomic DNA of PCC6803 strain was isolated and purified, and four kinds of ATPase genes were detected by PCR. After that, the protein was found in large quantities in Escherichia coli, and the protein was found in large quantities. In the future, the improvement of the development system will be carried out, and the improvement will be determined.