多義語コドンによる遺伝子発現機構と生物学的意義の解明

通过多义密码子阐明基因表达机制和生物学意义

• 批准号: 10780415
• 负责人: 鈴木 勉
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1998
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1998 至 1999
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-10780415/
• 关键词: Candida酵母; 多義語コドン; tRNA; CUGコドン; 修飾塩基; 変則暗号; LC; MS; CVGコドン

我々はCandida酵母においてCUGコドンがセリンとロイシンの2種のアミノ酸を同時に指定していることを、tRNAの解析と遺伝学的な手法により明らかにし、生物は多義的な遺伝暗号を積極的に使用し得ることを初めて示した。最終的に、多義的な遺伝暗号変換機構がCandida酵母において必要不可欠かどうかを明らかにするために、多義語コドンを司るtRNA^<Ser>CAGのロイシン受容能を変化させ、細胞内あるいは生育にどのような影響が生じるかを解析しようと試みている。これまでの解析によりtRNA^<Ser>CAGのロイシン受容能はアンチコドン3^'側隣接塩基である37位の1-メチルグアノシン(m^1G)のメチル基によって支配されていることが明らかになっている。今回はさらに受容能を向上させるために、73位の識別部位をGからAに改変することを試みた。細胞内に変異tRNAを発現させる前に、in vitroでロイシン受容能を評価するために、T7RNApolymeraseを用いた未修飾tRNAを作製したがロイシンの取り込みは全く検出されなかった。そこで、今回新たに大腸菌m^1Gmethylaseを組換えタンパク質として取得し、未修飾tRNAの37位をメチル化したところ、nativeなものと匹敵するロイシン受容能が確認された。この結果は分子内のたった一つのメチル基がアミノアシルtRNA合成酵素の決定因子になりうることを直接的に示した初めての例である。さらに、73位の識別部位をAに置換すると、ロイシン受容能は飛躍的に向上しnativeなtRNA^<Ser>CAGをはるかに凌ぐ活性が確認された。細胞内においても同様の活性が期待され、まずはG73A変異体をCandida maltosaに導入し細胞の表現系の変化を追跡する。

The two kinds of amino acids in Candida yeast are designated simultaneously, and the tRNA analysis and genetic analysis methods are used actively. The final, polysemous, genetic code change mechanism is Candida yeast, which must be understood, polysemous, polysemous<Ser>. The <Ser>analysis of this molecule shows that the receptor capacity of CAG can be changed from 1-mer to 3-mer at position 37 of CAG. Now, the receiver is up, and the 73-bit identifier is down. In vitro, T7 RNA is used to control the expression of tRNA. The expression of m^1Gmethylase in E. coli was confirmed by DNA sequencing and DNA sequencing. The result is a direct indication of the molecular determinants of tRNA synthase. The recognition site at position 73 was identified as A mutant<Ser>. The activity of the same gene in the intracellular cell was expected to be detected, and the expression of the G73A variant was traced.

项目成果

Yasukawa,T. et. al.: "Stability of mitochondrial tRNA molecules with pathogenic point mutations." Nucleic Acids Symposium Series. 39. 257-258 (1998)

安川，T.

Suzuki,T. etal.: "High sensitive analysis of modified nucleotides by LC/MS using ESI/iontrap mass spectrometry" Journal of Mass Spectrometry Society of Japan. (in press). (1999)

铃木，T.

Kondow,A. et al.: "An extra tRNA^<Gly>(U^*CU) found in arcidian mitochondria responsible for decoding non-universal codons AGA/AGG as glycine"Nucleic. Acids. Res.. 27. 2554-2559 (1999)

孔多，A.

Yasukawa,T. et al.: "Defect in modification at the anticodon wobble nucleotide of mitochondrial-tRNA^<Lys> with the MERRF Encephalomyopathy Pathogenic mutation"FEBS Lett.. 467. 175-178 (2000)

安川，T.

Yasukawa,T. et al.: "Modification defect at Anticodon wobble nucleotide of Mitochondrial tRNA^<Leu>(UUR) with pathogenic mutations of mitochondrial myophathy, Encephalopathy, Lactic Acidosis, and stooke-like Episodes"J. Biol Chem. 275. 4251-4257 (2000)

安川，T.