イノシトール3リン酸受容体のチャネル構成部位の構造と機能の解析

三磷酸肌醇受体通道成分的结构与功能分析

基本信息

批准号：
10780494
负责人：
道川貴章
金额：
$ 1.47万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1998
资助国家：
日本
起止时间：
1998 至 1999
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究は、細胞外刺激により産生されるイノシトール3リン酸(IP_3)の結合により開口するIP_3受容体(IP_3R)/Ca^<2+>放出チャネルの、チャネルポアを形成する領域、および四量体会合に関与する部位の同定を目的とし、以下の成果を得た。1 IP_3Rはほとんぼすべての細胞に発現していることから、これまで人為的に発現させたIP_3Rのみの性質を測定することは困難であった。本研究では、これまでに知られている3種類のIP_3Rサブタイプすべてについて遺伝子ノックアウトを施したDT-40細胞に、外来性のIP_3R遺伝子を導入し、安定にかつ大量の受容体タンパク質を発現する細胞株を得る方法を確立した。また、IP_3産生を引き起こすBCR刺激により、IP_3R遺伝子を導入したノックアウト細胞で細胞内Ca^<2+>濃度の上昇が見られ、この結果により外来性に発現させたIP_3Rが細胞内で正常にCa^<2+>放出チャネルとして機能していることが確認された(投稿準備中)。2 IP_3Rは細胞内小器官上に局在するチャネル分子であるために、パッチピペットを適用することが出来ず、通常のパッチクランプ法によるチャネル電流の測定が出来ない。本研究では、マイクロソーム画分を用いて、高頻度にIP_3Rチャネルを人工脂質二重膜に再構成する系を確立し、IP_3Rの電気生理学的測定を可能とした(Michikawa,T.,et al.,Neuron,1999)。以上本研究により、人為的に変異を加えたIP_3Rの性質を電気生理学的に測定する系が確立された。

这项研究旨在确定构成与IP_3受体（IP_3R）/Ca^<2+>释放通道四聚体关联的通道孔和位点的区域，这些区域是通过结合通过细胞外刺激产生的Inositol 3磷酸盐（IP_3）而打开的。 1由于IP_3R几乎在所有单元格中都表达，因此到目前为止，很难测量人工表达的IP_3R的性质。在这项研究中，我们建立了一种将外源IP_3R基因引入DT-40细胞中的方法，这些基因已被拆除，这些基因已将所有三种已知的IP_3R亚型拆除，以获得稳定的细胞系并表达大量受体蛋白。此外，触发IP_3产生的BCR刺激显示出用IP_3R基因转染的基因敲除细胞中细胞内Ca^<2+>浓度的增加，并且该结果证实了外源表达的IP_3R在细胞内的外源表达的IP_3R正常起作用，以供细胞内的CA^<2+>释放。 2由于IP_3R是位于细胞内细胞器上的通道分子，因此无法应用贴片移液管，并且无法使用通常的斑块夹方法测量通道电流测量。在这项研究中，我们建立了一个系统，该系统经常使用微体积分数重建IP_3R通道为人造脂质双层膜，从而允许IP_3R的电生理测量值（Michikawa，T。，T。等，等，Neuron，1999）。这项研究建立了一个系统，该系统可以从人工突变的IP_3R的性质上测量。