PCRランダム変異法による緑膿菌サイトトキシンの構造と機能に関する研究

PCR随机突变法研究铜绿假单胞菌细胞毒素的结构与功能

• 批准号: 11770136
• 负责人: 大西 真
• 金额: $ 1.47万
• 依托单位: Shinshu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1999
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1999 至 2000
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-11770136/
• 关键词: 緑膿菌; サイトトキシン; PCRランダム変異法; 細胞毒素; PCR変異法

PCRランダム変異法により、緑膿菌サイトトキシンの細胞傷害活性が低下した44種類の1アミノ酸置換変異毒素を得ることができた。変異毒素の定量化のために、毒素N末端領域に対応する9アミノ酸残基から成るペプチドを合成し、ペプチド抗体の作成を試みた。得られたペプチド抗体は、本毒素に対しての充分な感受性と特異性を持つことが明かとなった。7500倍希釈した抗ペプチド抗体を一次抗体として使用することにより精製野生型活性型毒素の12.5-100μg/mlをウエスタン法で定量化することが示された。得られた変異毒素の性状解析を行うために部分精製を試みた。しかしながら、81%の変異毒素は不溶性画分に存在した。発現条件を検討したが現在のところ可溶化の条件は見いだされなかった。一方、可溶性の変異毒素のなかでΔC20H201Rの比活性は野生型であるΔC20WTに比較して179倍以上低下していることが示された。ΔC20H201Rでは標的細胞膜結合能が著しく低下している可能性を示唆する知見を得た。このことは、201位近傍が毒素受容体への結合領域であることを示すものである。今後の研究の展開として、本研究で得られたΔC20H201Rは未だ明らかにされていない緑膿菌サイトトキシン受容体の同定に利用できるものと考えられる。更に今回得た多数の変異毒素の可溶化を実現する条件を見いだすことが、緑膿菌サイトトキシンの構造と機能に関する研究の進歩に重要であることと考える。

PCR assay was used to detect Pseudomonas aeruginosa cell injury activity. Among the 44 species, 1 was acid replacement isotoxin. Quantification of isotoxins, N-terminal domain of toxins, synthesis of isotoxins, and preparation of antibodies The antibody is sensitive to the toxin and specific to it. 7500 fold anti-toxin primary antibody was used to purify wild-type active toxin from 12.5 - 100 μ g/ml and quantified by the same method. The analysis of the characteristics of the toxin was carried out. 81% of the isotoxins are insoluble. The conditions of dissolution are discussed in detail. The specific activity of soluble isotoxin Δ C20H201R was 179 times lower than that of wild type isotoxin Δ C20WT.Δ C20H201R is the target cell membrane binding energy, and the possibility of lowering the binding energy is demonstrated. The binding domain of the toxin receptor near position 201 is shown below. Future studies will be carried out. In this study, we have found that Δ C20H201R is not fully utilized in the same way as Pseudomonas aeruginosa. In addition, it was found that the conditions for the solubilization of most of the isotoxins were important for the progress of research on the structure and function of Pseudomonas aeruginosa.