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病原性大腸菌の病原性発揮に関与する宿主細胞因子の解析

致病性大肠杆菌致病性涉及的宿主细胞因素分析

基本信息

批准号：
11770149
负责人：
阿部章夫
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Kitasato Institute
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至 2000
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-11770149/
关键词：
病原性大腸菌 EPEC タイプIII型分泌機構 DNAマイクロアレイ Rho DNAチップ

项目摘要

病原性大腸菌(enteropathogenic Escherichia coli、以下EPECと略す)は上皮細胞に付着し、その付着下部に細胞骨格形成に関る様々な蛋白を蓄積させる。この細胞骨格再編成の誘導は、タイプIII分泌機構により宿主に移行する蛋白質によって規定されている。細胞骨格の再編成には、低分子量GTP結合蛋白質のRhoファミリーが関与していることが知られているが、EPEC感染に伴う細胞骨格の再編成には、どのRhoファミリーが関与しているのかについては明らかにされていない。そこでドミナントネガティブのRhoファミリーを発現させた細胞で、EPEC感染における細胞骨格の再編成を観察した。その結果、Rho、Rac、Cdc42のドミナントネガティブ発現下においてもEPECは上皮培養細胞に付着し、アクチン凝集を惹起した。このことから、これらのRhoファミリーはEPECの細胞骨格再編成に関与しないことを明らかにした。現在、他のRhoファミリーについて解析を行なっている。一方、EPEC感染に際して、誘導あるいは抑制される宿主側因子を網羅的に解析するために、DNAマイクロアレイを用いて遺伝子レベルで解析することを試みた。試験菌には、EPEC野性株とタイプIII型分泌機構によって分泌されるEspB蛋白質の欠損株を用いて検討した。EspB欠損株では病原性が著しく低下していることを既に明らかにしている。in vivoでの感染実験では困難が予想されたので、まず初めにHeLa培養細胞を用いて検討した。両菌株をHeLa細胞に感染させると、培養後3時間で付着が観察された。しかしながら3時間の感染においては、培養細胞の障害も著しく感染初期に推移する遺伝子発現解析には困難が予想された。そこで、付着効率を上げるために、細菌の培養条件の検討を行なった。その結果、細菌の前培養にイーグル培地のような細胞培養用の培地を使用することで、付着効率をあげることができた。さらに感染後低速遠心により、細菌と培養細胞の接触を増すことでも付着の効率をあげることができた。イーグル培地の使用と遠心の操作を入れることにより、45分という短時間でEPECの細胞への付着を確立することができた。細胞からのmRNA調製の最適化を検討後、これらのmRNAより標識されたcDNAを作成し、DNAマイクロアレイにハイブリダイズさせ、感染に特異的に発現する、あるいは抑制される宿主側因子の解析を行う予定である。

Pathogenic Escherichia coli (EPEC) accumulates proteins in epithelial cells and in lower cellular bone formation. The induction of cellular reorganization and regulation of host migration proteins by secretory mechanisms The reorganization of cytoskeleton is related to the low molecular weight GTP binding protein Rho, Rho. In addition, the development of cell culture and the reorganization of cell culture in EPEC infection were observed. As a result, Rho, Rac and Cdc42 were found to be involved in the development and aggregation of epithelial cells. This is the first time that we've seen this. Now, he's in the middle of the analysis. The host side factor was analyzed when the virus was detected and induced by EPEC. EspB protein is secreted by type III secretory machinery in wild strains of E. coli. EspB is not pathogenic, but it is pathogenic. The infection in vivo was difficult to detect, and HeLa cells were initially cultured. HeLa cells were infected with the strain for six days and observed for three days after cultivation. It is difficult to analyze the expression of DNA in cultured cells during the initial stage of infection. The culture conditions of bacteria are discussed. The results of bacterial pre-culture and cell culture are as follows: After infection, the rate of infection increased. The use of remote control in the field of culture is a matter of time. Optimization of cellular mRNA modulation, preparation of cDNA for mRNA identification, identification of DNA, detection of infection-specific genes, and analysis of host-side factors