緑内障における線維柱帯ミオシリンの機能解析

小梁肌纤蛋白在青光眼中的功能分析

基本信息

批准号：
11771073
负责人：
大竹雄一郎
金额：
$ 1.41万
依托单位：
Keio University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至 2000
项目状态：
已结题

项目摘要

インフォームドコンセントを得た後に緑内障患者の手術から得られた線維柱帯組織を材料とし、当教室で作成したポリクロナール抗ミオシリン抗体を用いて免疫組織学的にその局在を検討した。光顕像では、ミオシリン抗体により線維柱帯組織全体にわたり梁構造がほぼ均一に染色された。またin situ hybridizationにより、線維柱帯細胞の核周囲に陽性反応を認めたことから、ミオシリン遺伝子が線維柱帯細胞で転写・発現していることが判明した(Curr Eye Res,2000)。さらに、免疫電顕法により、線維柱帯細胞において生成されたミオシリンが細胞内に分布していることが判明した。正常眼と開放隅角緑内障眼、ステロイド緑内障眼の線維柱帯組織を同様の方法で比較したが、ミオシリン発現強度と緑内障病型との相関は認めなかった。一方、日本人緑内障患者におけるミオシリン遺伝子変異について、開放隅角を呈する緑内障患者140名について解析した結果、アミノ酸置換を呈する4つの変異と6つの多型を認めた。ミオシリン変異を伴う開放隅角緑内障の頻度は2.9%であり、過去の報告と同様の頻度であった(Human Mutation,2000)。Asp208Glu変異家系では、正常眼圧緑内障を呈しており、ミオシリン変異と表現型が家族内で一致していた。Ile360Asn変異家系においては、原発開放隅角緑内障と高眼圧症と正常者が混在しており、同一のアミノ酸変異であっても表現型が異なる可能性があることを報告した(第11回緑内障学会)。培養ウシ線維柱帯細胞を用いて、細胞培養上清に分泌されたミオシリンタンパクを先の抗ミオシリン抗体を用いたウエスタンブロット法により検出した。500nMのデキサメサゾンを培養細胞に添加すると、上清のミオシリン分泌量は増強した。現在、デキサメサゾン添加時のウシ線維柱帯細胞の形態的変化とミオシリンの細胞内局在を、免疫電顕法を用いて引き続き検討中である。

在获得知情同意后，检查了在青光眼患者中从手术中获得的小梁组织的定位，并以材料为材料，并使用在我们教室中制备的多克隆抗肌蛋白抗体来检查免疫组织化学定位。在光显微镜图像中，束结构几乎均匀地在整个小梁组织中用肌动蛋白抗体染色。此外，原位杂交揭示了小梁细胞周围的阳性反应，该反应表明肌动蛋白基因是转录的，并在小梁细胞中表达（Curr Eye Res，2000）。此外，免疫电子显微镜表明，小梁细胞中产生的肌钙蛋白分布在细胞中。尽管以类似的方式比较了正常眼睛，开角青光眼的眼睛和类固醇青光眼眼睛的小梁组织，但在肌硅素表达的强度与青光眼疾病的类型之间没有观察到相关性。另一方面，对日本青光眼患者的肌钙蛋白基因突变进行了分析，140例表现出开放角度的青光眼患者，四个突变和6种多态性表现出氨基酸取代。与以前的报道相似的肌硅蛋白突变的开角型青光眼的频率为2.9％（Human Stutation，2000）。在ASP208GLU突变家族中，存在正常的眼内青光眼，肌动蛋白突变和表型在家族中是一致的。在ILE360ASN突变家族中，混合了原发性开角青光眼，眼部高血压和正常个体，我们报告说，即使是同一氨基酸突变也可能在表型中有所不同（第11届青光眼学会）。使用培养的牛小梁索细胞，通过使用先前的抗乳腺素抗体的蛋白质印迹检测细胞培养上清液中分泌的肌细胞蛋白。在培养的细胞中添加500 nm的地塞米松增强了上清液中肌钙蛋白分泌的量。当前，使用免疫电子显微镜研究了牛牛小梁细胞的形态变化和肌硅蛋白的亚细胞定位。