プロテインチロシンフォスファターゼが調節するチロシンキナーゼのクローニング

1.Co-precipitation,Western blot analysis:In VitroでのHCKとYopHの相互作用を確認するため、YopH-GST融合タンパクを吸着させたグルタチオンセファロビーズをU937細胞上清内で撹拌し、吸着物をSDS PAGEによって分離し、ニトロセルロースフィルターにトランスファーした後、抗HCK抗体でimmunoblottingを行った。YopH-GSTタンパクはタンパク相互作用を示すプロリンリッチシークエンスを有するものと、同シークエンスdeletion mutantしたものを使用した。その結果プロリンリッチシークエンスをもつYopH-GSTタンパクのみが、抗HCK抗体でimmunoblottingされた。2.Immunoprecipitation:In Vivoでの相互作用を確認するためYopHとHCKをそれぞれ293細胞内に発現させ、免疫沈降を行った。その結果プロリンリッチシークエンスを有するWildtype YopHのみが抗HCK抗体によって免疫沈降され、プロリンをアラニンに置換したmutantでは相互作用が確認されなかった。以上の結果フォスファターゼYopHは細胞内で直接HCKと相互作用することが同研究で明らかになり、HCKのキナーゼ活性を制御する可能性が示唆された。今後HCKのどの部位のチロシンのリン酸化をYopHが制御しているのか、明らかにする事でHCKのキナーゼ活性のメカニズムの解明を行う予定である。

1.Co-precipitation,Western blot analysis:In VitroでのHCKとYopHの相互作用を確認するため、YopH-GST融合タンパクを吸着させたグルタチオンセファロビーズをU937細胞上清内で撹拌し、吸着物をSDS PAGEによって分離し、ニトロセルロースフィルターにトランスファーした後、抗HCK抗体でimmunoblottingを行った。YopH-GSTタンパクはタンパク相互作用を示すプロリンリッチシークエンスを有するものと、同シークエンスdeletion mutantしたものを使用した。その結果プロリンリッチシークエンスをもつYopH-GSTタンパクのみが、抗HCK抗体でimmunoblottingされた。2.Immunoprecipitation:In Vivoでの相互作用を確認するためYopHとHCKをそれぞれ293細胞内に発現させ、免疫沈降を行った。その結果プロリンリッチシークエンスを有するWildtype YopHのみが抗HCK抗体によって免疫沈降され、プロリンをアラニンに置換したmutantでは相互作用が確認されなかった。以上の結果フォスファターゼYopHは細胞内で直接HCKと相互作用することが同研究で明らかになり、HCKのキナーゼ活性を制御する可能性が示唆された。今後HCKのどの部位のチロシンのリン酸化をYopHが制御しているのか、明らかにする事でHCKのキナーゼ活性のメカニズムの解明を行う予定である。