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プロテインチロシンフォスファターゼが調節するチロシンキナーゼのクローニング

蛋白酪氨酸磷酸酶调节酪氨酸激酶的克隆

基本信息

批准号：
11771193
负责人：
橋爪英城
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Nihon University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至 2000
项目状态：
已结题

项目摘要

1.Co-precipitation,Western blot analysis:In VitroでのHCKとYopHの相互作用を確認するため、YopH-GST融合タンパクを吸着させたグルタチオンセファロビーズをU937細胞上清内で撹拌し、吸着物をSDS PAGEによって分離し、ニトロセルロースフィルターにトランスファーした後、抗HCK抗体でimmunoblottingを行った。YopH-GSTタンパクはタンパク相互作用を示すプロリンリッチシークエンスを有するものと、同シークエンスdeletion mutantしたものを使用した。その結果プロリンリッチシークエンスをもつYopH-GSTタンパクのみが、抗HCK抗体でimmunoblottingされた。2.Immunoprecipitation:In Vivoでの相互作用を確認するためYopHとHCKをそれぞれ293細胞内に発現させ、免疫沈降を行った。その結果プロリンリッチシークエンスを有するWildtype YopHのみが抗HCK抗体によって免疫沈降され、プロリンをアラニンに置換したmutantでは相互作用が確認されなかった。以上の結果フォスファターゼYopHは細胞内で直接HCKと相互作用することが同研究で明らかになり、HCKのキナーゼ活性を制御する可能性が示唆された。今後HCKのどの部位のチロシンのリン酸化をYopHが制御しているのか、明らかにする事でHCKのキナーゼ活性のメカニズムの解明を行う予定である。

1.Co-precipitation, Western blot analysis:In Vitro HCK, YopH interaction confirmation, YopH-GST fusion, U937 cell supernatant mixed with SDS of absorbent material After PAGE separation, immunoblotting of anti-HCK antibodies. YopH-GST タンパクはタンパク INTERACTION SYNOPSISチシークエンスを有するものと、同シークエンスdeletion mutantしたものを用した.そのRESULTSプロリンリッチシークエンスをもつYopH-GSTタンパクのみが, anti-HCK antibody でimmunoblottingされた. 2. Immunoprecipitation: In Vivo interaction confirmation, YopH, HCK, 293 intracellular detection, immunoprecipitation, and immunoprecipitation.そのRESULTSプロリンリッチシークエンスを有するWildtype YopHのみがanti-HCK antibodyによってimmunoprecipitationされ,プロリンをアラニンにsubstitutionしたmutantではinteractionがconfirmationされなかった. The above results indicate direct HCK interaction within the YopH cell and the interaction between YopH and HCKが Same research on the で明らかになり, HCK のキナーゼactivity をcontrol する possibility and indication された. From now on, HCK's のどのparts のチロシンのリン acidified をYopHがcontrol しているのか,明らかにする事でHCKのキナーゼACTIVE のメカニズムの解明を行う定である.