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アミノ基転移酵素およびその人工変異体の高次構造と作用機作の解析

转氨酶及其人工突变体的高阶结构和作用机制分析

基本信息

批准号：
03453162
负责人：
広津健
金额：
$ 2.24万
依托单位：
Osaka City University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (B)
财政年份：
1991
资助国家：
日本
起止时间：
1991 至 1993
项目状态：
已结题

项目摘要

補酵素がピリドキサミン5′-リン酸型の大腸菌アスパラギン酸アミノ基転移酵素(PMP-AspAT)について、高分解能X線構造解析を行った。回折強度データは高エネルギー物理学研究所の放射光を用い、巨大ワイセンベルグカメラで収集した。AspATは分子量44000のサブユニット2個からなる2量体で、2回対称軸を持っている。PMP-AspATの全体構造は、すでに構造決定した補酵素がピリドキサールリン酸でるAspAT(PLP-AspAT)と同じopen型であった。PMP-AspAT・succinateの全体構造は、PLP-AspAT・2-methylaspartateの構造とよく似ており、PMP-AspATもPLP-AspATと同様に、基質結合時にopen型からclosed型に分子全体が大きなコンホメーション変化を起こすことが明らかになった。基質を認識するArg292はopen型のPMP-AspATでは内側を向いており、PLP型とは異なっていた。PMP-AspAT・glutarateの全体構造は、予想に反してopen型であった。基質阻害剤であるglutarateは、活性部位の人口付近に存在し、closed型のPMP-AspATのsuccinateの結合様式とは大きく異なっていた。このことは、PMP-AspATとC_5基質である2-oxoglutarateの複合体は溶液中でopen型とclosed型の平衡ににあり、open型の複合体の方がより多いとの分光学的実験の結果と一致する。またこれはopen型AspAT複合体の3次構造決定の最初の例である。活性部位のPLPのO3と相互作用している、Asn194をAlaで置換したAsn194Ala、Asn194とTyr225を置換した2置換変異型酵素Asn194la+Tyr225PheのX線結晶構造解析を行った。失われたO3とAsn194の水素結合は、新たに水分子が入ることにより回復されていた。これがAsn194Alaが活性をかなり維持している理由である。また2置換変異型酵素はほとんど失活しているが、これはO3とTyr225の水素結合が失われ、O3上の負電荷がピリジン環内に流れ込み、シッフ塩基のpKaを上げたためである。これらの変異型酵素の全体構造は野生型と同じで、活性部位の構造も変異部分を除いて野生型と同じであった。

Enzyme supplement がピリドキサミン 5′-リン acid-type coliform アスパラギン acid アミノbase転Transfer enzyme (PMP-AspAT) is used, and high-degradation energy X-ray structural analysis is performed. The intensity of the return is high and the radiation intensity of the Institute of Physics is high, and the huge intensity of the radiation is collected. AspAT has a molecular weight of 44,000, a two-dimensional body, and a two-dimensional symmetrical axis. PMP-AspAT's overall structure is determined by its structure, and its structure is determined by its enzyme-replenishing enzyme, the acidic acid AspAT (PLP-AspAT), which is the same as the open type. PMP-AspAT・succinate’s overall structure, PLP-AspAT・2-methylaspartate’s structure and structure, PMP-Asp ATもPLP-AspATとopen typeからclose when combined with matrix The entire d-type molecule is a large one. The matrix を recognizes the open type するArg292 のPMP-AspAT では inner を directional いており, PLP type とはなっていた. PMP-AspAT・Glutarate's overall structure is the same as the open type. Matrix blocking agent is glutarate, the active site is close to the population, and the closed type of PMP-AspAT is succinate.このことは、PMP-AspATとC_5 matrix である2-oxoglutarate のcomplex in solution でope The results of n-type and closed-type balance and open-type complex are consistent. This is the first example of the third structure of the open AspAT complex. Active site のPLP のO3 と interaction している、Asn194 をAla で replacement したAsn194Ala 、Asn194 X-ray crystal structure analysis of とTyr225をsubstitution した2 substitution 変 isoenzyme Asn194la+Tyr225Pheを行った. The water molecules that have been lost are O3 and Asn194, and the water molecules that are new are being returned to the water molecules.これがAsn194AlaがActivityをかなりMaintenanceしているreasonである.また2 replacement isoform enzyme はほとんど inactivation しているが、これはO3 とTyr225 のhydrogen binding がわれ, the negative charge on O3 is the がピリジン inner ring に流れ込み, and the シッフ塩基のpKaを上げたためである. The overall structure of the isoenzyme is the same as that of the wild type, and the structure of the active part is the same as that of the wild type.