定向性進化の原理を利用したアミノ基転移酵素の基質特異性の変換

利用定向进化原理转换转氨酶的底物特异性

• 批准号: 10780427
• 负责人: 矢野 貴人
• 金额: $ 1.47万
• 依托单位: Osaka Medical College
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1998
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1998 至 1999
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-10780427/
• 关键词: 進化分子工学; タンパク質工学; 分子進化; 基質特異性; アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ; Directed evolution

Directed evolution(進化分子工学)により、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼのβ-分枝鎖アミノ酸に対する触媒効率が、野生型酵素と比較して、約200万倍増大した変異型酵素を得た。進化した酵素には、計17アミノ酸残基に変異がみられた。興味深いことに、その17残基のうち、基質と直接相互作用が可能な位置に存在するものは1残基のみであった。他の残基に関しては、どのような機構で基質結合に影響を与えるのかは全く不明であった。そこで、進化した酵素とバリン類似物質との複合体の構造をX線結晶解析により調べた。その結果、17残基の変異により・酵素のドメイン構造とサブユニット間の配置が変化している。・それにより、基質結合部位を含む活性部位の構造が変化している。ことが判明した。変異残基・構造変化・活性変化の間の関係を詳しく解析するために、・変異残基の多くが立体構造上3つのクラスターを形成していることに着目し、各クラスターを様々な組み合わせで持つ全8種の変異型酵素を作製した。・各変異型酵素の活性等、酵素学的諸性質を調べ、野生型酵素やATB17と比較した。・各変異型酵素の構造をX線結晶解析により調べ、野生型酵素やATB17と比較した。その結果、定向進化の過程で導入された変異が、どのような機構により本酵素のβ-分枝鎖アミノ酸基質に対する活性を上昇させるのかが、明らかになりつつある。

Directed evolution (advanced molecular engineering), β-branching, β-branching, catalytic activity, wild-type enzyme ratio, and about 2 million-fold enzyme yield. The enzyme enzyme was purified, and the acid residue was purified by 17%. It is possible that there is a "position" in the position of "deep taste", "17 residues", "17 residues" and "direct interaction". He

项目成果

Yano,T.: "Directed evolution of an aspartate aminotransferase with new substrate specificities" Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 95・10. 5511-5515 (1998)

Yano，T.：“具有新底物特异性的天冬氨酸氨基转移酶的定向进化”，美国科学院院刊 95·10。

Hoseki,J.: "Directed evolution of thermostable kanamycin-resistance gene:a convenient selection marker for Thermus thermophilus"J.Biochem.. 126・5. 951-956 (1999)

Hoseki, J.：“耐热卡那霉素抗性基因的定向进化：嗜热栖热菌的便捷选择标记”J.Biochem.. 126・5（1999）。

Oue,S.: "Cocrystallization of a mutant aspontate aminotransferase with a C5-dicarboxylic substrate analog:structural comparison with the enzyme-C4-dicarboxylic analog complex"J.Biochem.. 127・2. 337-343 (2000)

Oue, S.：“突变体天冬氨酸氨基转移酶与 C5-二羧酸底物类似物的共结晶：与酶-C4-二羧酸类似物复合物的结构比较”J.Biochem.. 127・2 (2000)。

Oue,S.: "Redesigning the substate specificity of an enzyme by cumulative effects of the mutations of non-active site residues" J.Biol.Chem.274・4. 2344-2349 (1999)

Oue, S.：“通过非活性位点残基突变的累积效应重新设计酶的亚状态特异性”J.Biol.Chem.274·4 2344-2349 (1999)。