アメフラシ抗菌・抗がんタンパク質アプリシアニンAの大量調製

海兔抗菌/抗癌蛋白aplycyanin A的规模化制备

• 批准号: 12760141
• 负责人: 神保 充
• 金额: $ 1.09万
• 依托单位: Kitasato University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 2000
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2000 至 2001
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-12760141/
• 关键词: アプリシアニンA; 抗菌タンパク質; L-アミノ酸酸化酵素; 過酸化水素; 抗腫瘍タンパク質; アプリシアニン; アメフラシ; L-アミノ酸・酸化酵素

抗菌・抗腫瘍タンパク質アプリシアニンA(APA)は抗生物質に較べ10倍以上高い活性を持つが、その活性については明らかにされていなかった。近年、APAのアミノ酸配列が決定され、低いながら全体的な相同性をもつタンパク質としてL-アミノ酸酸化酵素(LAAO)が存在することがわかった。この酵素はL-アミノ酸を基質として過酸化水素を発生させる酵素であり、産生された過酸化水素により抗菌作用や抗腫瘍作用が発現される。その活性中心にはフラビンアデニンジヌクレオチドを持っている。そこで、APAの機能を検討する第一段階として、APAを発現させることを検討した。APA遺伝子をもつ発現プラスミドを作成し大腸菌BL21star(DE3)を用いて、リボフラビンを含む培地で培養した。室温で培養を行ったところ、可溶画分に組換えAPA(rAPA)が発現された。得られたrAPAについて、D-およびL-フェニルアラニンを用いてLAAO活性を測定を行ったところ、D体では過酸化水素が発生せず、L体で過酸化水素の発生が見られることがわかった。また、枯草菌Bacillus subtilisを用いて50%増殖阻害濃度を測定したところ、APAでは12.6μg/ml, rAPAでは9.6μg/mlであり、同様な活性を有していることが分かった。したがって、APAと同等の活性を持つrAPAを大腸菌で発現させることに成功した。しかし、典型的な実験でのrAPAの収量は1Lの培養液あたり0.2mgであり、大量に得ることはできなかった。主な原因として、rAPAを発煙させる際に、ほとんどのrAPAが不溶化することが挙げられる。これは大腸菌で外来タンパク質を発現させるとしばしば起こる現象であり、不溶部分の再活性化も検討したが、活性を持つrAPAを得ることはできなかった。従って、大量発現を目指すためには、昆虫細胞系を用いて実験を行う必要があると考えられる。

Antibacterial and anti-inflammatory substance A(APA) has more than 10 times higher activity than other antibiotics. In recent years, APA's acid sequence has been determined, and the identity of all low middle and low middle levels has been determined. This enzyme produces both antibacterial and anti-inflammatory effects on the production of peracidified hormones. The activity center of the company is located in the middle of the city. The first stage of APA's function is discussed. APA's function is discussed. APA gene expression system was developed to produce E. coli BL21star (DE3), which was cultured in vitro and in vitro. Room temperature incubation, soluble components, APA(rAPA), were developed. The activity of LAAO was determined by the method of APA detection, D-test and L-test, and the production of peracidified water in D and L bodies was determined by the method of LAAO activity detection. Bacillus subtilis 50% growth inhibition concentration was determined, APA 12.6μg/ml, rAPA 9.6μ g/ml, same activity was determined. The activity of APA and its equivalent was successfully detected. The typical amount of rAPA is 1L of culture medium, 0.2 mg, a large amount of rAPA. The main reason is that rAPA is not soluble. This is the first time that foreign substances have been detected in E. coli, and the reactivation of insoluble parts has been investigated. A large number of insect cell lines were identified and tested.

项目成果

M.Jimbo, F.Nakanishi, R.Sakai, K.Muramoto, H.Kamiya: "Expression of the Antitumour-Antibacterial Glycoprotein Aplysianin A in Escherichi a coli"Fisheries Science (JSFSのproceedings).

M.Jimbo、F.Nakanishi、R.Sakai、K.Muramoto、H.Kamiya：“抗肿瘤抗菌糖蛋白海兔素 A 在大肠杆菌中的表达”渔业科学（JSFS 论文集）。

H.Kamiya, M.Jimbo, H.Yako, O.Nakamura, R.Kado, T.Watanabe: "Participation of the C-type herolymph leetin in mineralization of the acorn barnacle Megabalanus rosa"Marine Biology.

H.Kamiya、M.Jimbo、H.Yako、O.Nakamura、R.Kado、T.Watanabe：“C 型英雄淋巴凝集素参与橡子藤壶 Megabalanus rosa 的矿化”海洋生物学。

M.Yamaguchi,T.Ogawa,K.Maramoto,M.Jimbo,H.Kamlya: "Effects of culture conditions on the expression level of lectin in Microcystis aeruginosa (freshwater cyanobacterium)"Fisheries Science. 66・4. 665-669 (2000)

M. Yamaguchi、T. Okawa、K. Maramoto、M. Jimbo、H. Kamlya：“培养条件对铜绿微囊藻（淡水蓝细菌）凝集素表达水平的影响”渔业科学 665-669。 2000）

Mitsuru Jimbo,M.Yamaguchi,k.Muramoto,H.Kamlya: "Cloning of the Microcystis aeruginosa M228 Lectin (MAL) gene"Biochemical and Biophysical Research Communications. 273・2. 499-504 (2000)

Mitsuru Jimbo、M. Yamaguchi、k. Muramoto、H. Kamlya：“铜绿微囊藻 M228 凝集素 (MAL) 基因的克隆”生物化学和生物物理研究通讯 273·2 (2000)。