微細類からの有用炭化水素合成酵素遺伝子の探索

从微生物中寻找有用的碳氢化合物合酶基因

基本信息

批准号：
12760137
负责人：
岡田茂
金额：
$ 1.47万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至 2001
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-12760137/
关键词：
微細藻類緑藻 Botryococcus braunii 炭化水素スクアレン生合成酵素遺伝子

项目摘要

群体性微細緑藻Botryococcus brauniiは光合成により固定した二酸化炭素を、大量の液状炭化水素に変換、蓄積するため、再生産可能なエネルギー資源としての利用が考えられている。本藻種には炭化水素として脂肪酸由来の直鎖状のalkadiene、alkatrieneを生産するA品種、トリテルペンであるbotryococcene類およびスクアレン誘導体を生産するB品種、テトラテルペンであるlyopadieneを生産するL品種の3品種があり、これらの中で炭化水素の質および含量の点からエネルギー資源として最も有望なのはB品種である。本藻種による有用炭化水素生産を行うためには、炭化水素合成酵素遺伝子に関する知見を得ることが必要である。そこでB品種であるBerkeley株からトリテルペン合成酵素遺伝子の探索を試みた。前年度までにBerkeley株から作成されたcDNAライブラリーのスクリーニングにより得られた遺伝子は、スクアレン合成酵素に存在する5つの活性ドメインの内、4つまでを保持していた。そこでこの遺伝子をpET11ベクターに導入し大腸菌内で発現させた。この大腸菌のホモジネートを用いてスクアレン合成酵素およびbotryococcene合成酵素活性を測定したが、目的のタンパク質が封入体画分に存在していたため、いずれの酵素活性も検出できなかった。そこでpET32ベクターを用いてチオレドキシンとの融合タンパクとして本遺伝子を発現させたところ可溶性タンパク質が得られたが、botryococcene合成酵素活性は示さなかった。これは原核生物内では活性の発現に必要なタンパク質の修飾が行われないためであると考えられた。そこで現在、本遺伝子の酵母での発現を試みている。

菌落微胶质藻类braunii braunii转换并累积通过光合作用固定在大量液态烃中的二氧化碳，因此被认为用作可再现能源。藻类种类包括三种类型：源自脂肪酸作为碳氢化合物的线性烷二烯，一种产生烷二烯的一种品种，三萜烯苯乙烯 - 苯乙烯和索具衍生物，以及产生四乙烯lyopadiene的L品种。在这些方面，就碳氢化合物的质量和内容而言，B品种是最有希望的能源。为了通过这种藻类物种产生有用的碳氢化合物，有必要获得有关碳氢化合物合酶基因的知识。因此，我们试图从B-Varietal Berkeley菌株中搜索三萜合酶基因。通过筛选从伯克利菌株产生的cDNA文库获得的基因，最多可在孢子合酶中存在的五个活性域中的四个。然后将该基因引入PET11载体，并在大肠杆菌中表达。使用该大肠杆菌匀浆测量了鳞状合酶和杂霉菌合酶活性，但是由于感兴趣的蛋白质存在于包容体分数中，因此无法检测到任何酶活性。因此，使用PET32载体将基因表示为硫蛋白的融合蛋白，并获得了可溶性蛋白，但未显示出杂化蛋白合成酶的活性。人们认为这是因为在原核生物中没有进行活性表达所必需的蛋白质的修饰。因此，我们目前正在尝试在酵母中表达该基因。