超好熱古細菌ゲノムの体系的機能解析のための分子遺伝学的基盤の構築

构建超嗜热古菌基因组系统功能分析的分子遗传学基础

基本信息

批准号：
12760226
负责人：
野村紀通
金额：
$ 1.41万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至 2001
项目状态：
已结题

项目摘要

1.相同組換えによる1ステップ遺伝子破壊実験系において,破壊株の出現頻度を10^3-10^4cfu/μgDNA程度にまで高めることができた.古細菌Aeropyrum pernixゲノム上には7つのメチル化修飾酵素遺伝子があるが,それらすべてを組換えタンパク質として調製し混合した.その酵素混合物により導入するDNA断片を予めメチル化処理することにより宿主の制限修飾系バリアを効果的に乗り越えることが可能となった.2.古細菌ゲノム特有のorphan genesのうち,無作為に選んだ約90の遺伝子に対してその破壊を試みた.現在までに67の遺伝子破壊株が作製できた(全ORFの2.6%にあたる).これらの破壊株について,表現型の評価(増殖温度,低温ショック応答,UV感受性,栄養要求性,増殖基質の資化性,各種阻害剤の影響)を進めている.ΔAPE0461株がUV高感受性であること,さらにはゲノム上に人為的に導入した二本鎖DNA切断(DSB)を修復できないことが明らかになっている.3.A.pernix集団内で,ゲノム上の特定の遺伝子の構造に多型を形成させる可動遺伝因子として"動くイントロン(mobile intron)"を発見した.その伝播戦略に必須な因子として,イントロン自身にコードされる部位特異的DNAニンドヌクレアーゼを二つ同定した(l-ApeIおよびl-ApeII).これらは20塩基前後の二本鎖DNA塩基配列を認識・切断するrare-cutting enzymeであった.この二つの酵素は,ゲノム地図作製等に有用であると考えられることから,宝酒造から市販されることが決定されている.4.産業上有用な種々の酵素のゲノム規模での探索とそれらの生化学的性質の解析を並行して進めた.現在までに,未報告の5塩基対の配列を認識する新規制限酵素ApeKl(遺伝子はAPE0558)や分泌型セリンプロテアーゼ(APE0263)をはじめとする17種の酵素の解析を終えた.いずれも高い安定性を有しており遺伝子工学,食品加工,臨床検査等の分野で実用可能と考えられる.

1。在使用同源重组的一步基因破坏实验系统中，破坏菌株的频率增加到约10^3-10^4CFU/μgDNA。 pernix pernix基因组上有七个甲基化修改的酶基因，所有这些酶基因均已制备并混合为重组蛋白。通过提前通过酶混合物引入的DNA片段，可以有效克服宿主的限制性障碍。 2。孤儿，是基因的考古细菌基因组独有的，我们试图破坏大约90个随机选择的基因的基因。迄今为止，已经产生了67个基因脱落（占所有ORF的2.6％）。对于这些diss虫，我们目前正在进行表型评估（生长温度，冷休克响应，紫外线敏感性，成相体，生长底物以及各种抑制剂的影响）。据揭示，ΔAPE0461具有高度紫外线敏感性，并且无法修复人为引入基因组的双链DNA断裂（DSB）。3.a。在Pernix种群中，移动内含子是“移动内含子”，作为在基因组特定基因结构中形成多态性的移动遗传因素。我们发现“内含子”是其传播策略的重要因素，这是内含子本身（L-Apei和L-apeii）编码的两个位点特异性DNA NINDONECLEAS。这些罕见切割用于识别和切割20个基部约20个碱基的双链DNA核苷酸序列。是酶。这两种酶被认为对基因组映射很有用，并已决定从Takara Shuzo商业上购买。 4。我们对各种工业有用的酶进行了基因组搜索，并分析了它们的生化特性。迄今为止，我们已经完成了17种酶的分析，包括新型限制酶APEKL（Gene是APE0558）和分泌的丝氨酸蛋白酶（APE0263），该蛋白酶（APE0263）识别未报告的五个基准对序列。所有这些都具有很高的稳定性，并且被认为在基因工程，食品加工和临床测试等领域都是实用的。