超好熱古細菌ゲノムの体系的機能解析のための分子遺伝学的基盤の構築

构建超嗜热古菌基因组系统功能分析的分子遗传学基础

• 批准号: 12760226
• 负责人: 野村 紀通
• 金额: $ 1.41万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 2000
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2000 至 2001
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-12760226/
• 关键词: 古細菌; 逆遺伝学; 遺伝子破壊; 超好熱菌; イントロン; ホーミング; ゲノム; 進化

1.相同組換えによる1ステップ遺伝子破壊実験系において,破壊株の出現頻度を10^3-10^4cfu/μgDNA程度にまで高めることができた.古細菌Aeropyrum pernixゲノム上には7つのメチル化修飾酵素遺伝子があるが,それらすべてを組換えタンパク質として調製し混合した.その酵素混合物により導入するDNA断片を予めメチル化処理することにより宿主の制限修飾系バリアを効果的に乗り越えることが可能となった.2.古細菌ゲノム特有のorphan genesのうち,無作為に選んだ約90の遺伝子に対してその破壊を試みた.現在までに67の遺伝子破壊株が作製できた(全ORFの2.6%にあたる).これらの破壊株について,表現型の評価(増殖温度,低温ショック応答,UV感受性,栄養要求性,増殖基質の資化性,各種阻害剤の影響)を進めている.ΔAPE0461株がUV高感受性であること,さらにはゲノム上に人為的に導入した二本鎖DNA切断(DSB)を修復できないことが明らかになっている.3.A.pernix集団内で,ゲノム上の特定の遺伝子の構造に多型を形成させる可動遺伝因子として"動くイントロン(mobile intron)"を発見した.その伝播戦略に必須な因子として,イントロン自身にコードされる部位特異的DNAニンドヌクレアーゼを二つ同定した(l-ApeIおよびl-ApeII).これらは20塩基前後の二本鎖DNA塩基配列を認識・切断するrare-cutting enzymeであった.この二つの酵素は,ゲノム地図作製等に有用であると考えられることから,宝酒造から市販されることが決定されている.4.産業上有用な種々の酵素のゲノム規模での探索とそれらの生化学的性質の解析を並行して進めた.現在までに,未報告の5塩基対の配列を認識する新規制限酵素ApeKl(遺伝子はAPE0558)や分泌型セリンプロテアーゼ(APE0263)をはじめとする17種の酵素の解析を終えた.いずれも高い安定性を有しており遺伝子工学,食品加工,臨床検査等の分野で実用可能と考えられる.

1. In the same group え に よ る 1 ス テ ッ プ heritage 伝 son broken 壊 be 験 department に お い て, broken frequency 壊 strains の を 10 ^ 3-10 ^ 4 cfu/mu gDNA degree に ま で high め る こ と が で き た. Archaea Aeropyrum On pernix ゲ ノ ム に は 7 つ の メ チ ル traces of the modified enzyme 伝 son が あ る が, そ れ ら す べ て を group in え タ ン パ ク qualitative と し て modulation し mixed し た. そ の enzyme mixture に よ り import す る DNA fragment を to め メ チ ル change 処 Richard す る こ と に よ り の host system modification is limited バ リ ア を unseen fruit に 乗 り more え る こ と が may と な Youdaoplaceholder0.2 The archaea ゲ ノ ム の unique orphan genes の う ち, inaction に choose ん だ about 90 の heritage 伝 son に し seaborne て そ の broken 壊 を try み た. Now ま で に 67 の heritage 伝 system broken 壊 strains が son で き た (whole ORF の 2.6% に あ た る). こ れ ら の broken 壊 strains に つ い て, phenotype の review 価 (raised colonization temperature, low temperature シ ョ ッ ク 応 answer, UV sensitivity, tech students.their ownship requires sexual, raised colonization matrix の endowment elasticity,) effect of resistance to harm tonic の を into め て い る. Δ APE0461 が UV Gao Gan strains By sexual で あ る こ と, さ ら に は ゲ ノ ム に on artificial に import し た 2 lock cut off (DSB) を repair DNA で き な い こ と が Ming ら か に な っ て い る. 3. Amy polumbo ernix set 団 で, ゲ ノ ム の on specific の heritage 伝 son の construct に を formed さ せ る movable heritage 伝 factor と し て "dynamic く イ ン ト ロ ン (mobile Exon)) "を 発 see し た. そ の 伝 sowing 戦 slightly に must な factor と し て, イ ン ト ロ ン itself に コ ー ド さ れ る site specific DNA ニ ン ド ヌ ク レ ア ー ゼ を two つ with fixed し た (l - ApeI お よ び l - ApeII). こ れ ら は 20 salt salt base の 2 lock before and after DNA base with column を know, cut off す る rar E - cutting enzyme で あ っ た. こ の two つ の enzyme は, ゲ ノ ム to 図 cropping systems and other useful に で あ る と exam え ら れ る こ と か ら, treasure wine made か ら city vendor さ れ る こ と が decided さ れ て い る. 4. In the industry, there are な kinds of 々 enzyme <e:1> ゲノム scale で <e:1> exploration とそれら biochemical properties <e:1> analysis を parallel て て advancement めた. Now ま で に, failing to report の 5 salt base の seaborne match column を know す る ApeKl new regulation limiting enzyme (legacy 伝 son は APE0558) type や secretion セ リ ン プ ロ テ ア ー ゼ (APE0263) を は じ め と す る 17 の enzyme の parsing を eventually え た. い ず れ も high い stability を し て お り heritage 伝 engineering, food processing, clinical 検 check, etc The practical application of で may be と to えられる.

项目成果

Sako, Y., Nomura, N.: "Bergey's Manual of Systematic Bacteriology (2nd Ed.) Volume 1"Springer-Verlag. 721 (2001)

Sako, Y.，Nomura, N.：“伯吉系统细菌学手册（第二版）第 1 卷”施普林格出版社。

野村紀通 ら: "月刊海洋 No.23号外(特集「海洋微生物」)"海洋出版株式会社. (2000)

野村典道等：《月刊海洋第23期特辑（特辑“海洋微生物”）》海洋出版株式会社（2000年）

Techibana,A. et al.: "Novel prenyltransferase gene encoding farnesylgeranyl diphosphate synthase from a hyperthermophilic archaron, Aeropyrum pernix"European Journal of Biochemistry. 267・2. 321-328 (2000)

Techibana，A.等人：“编码来自超嗜热阿卡龙（Aeropyrum pernix）的法呢基香叶基二磷酸合酶的新型异戊烯基转移酶基因”欧洲生物化学杂志267·2（2000）。

Sako,Y. et al.: "Bergey's Manual of Systematic Bacteriology (2nd Ed.)"Springer-Verlag(印刷中). (2001)

Sako, Y. 等人：“Bergey 的系统细菌学手册（第二版）”Springer-Verlag（印刷中）。