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ゲノム工学技術への応用をめざした人工レアカッター酵素の開発と分子設計原理の解明

人工稀有切割酶的开发和应用于基因组工程技术的分子设计原理的阐明

基本信息

批准号：
16780232
负责人：
野村紀通
金额：
$ 2.37万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至 2005
项目状态：
已结题

项目摘要

LAGLIDADG型ホーミングエンドヌクレアーゼ(HEase)は14〜40bpの長いDNA配列牽認識するレアカッター酵素である。本年度はHEaseの標的DNA配列認識に関わる機能構造を特定する目的で,超好熱古細菌由来のHEase, I-ApeIIの遺伝子にランダム変異を導入し,その変異表現型の包括的な解析を行った.その結果,野生型に比べて認識配列の長さが短縮した変異体の取得に成功した.野生型I-ApeIIは5'-CTGACTCTC^TTAA*GGTAGCCAA(*および^はそれぞれtop strand, bottom strandの切断部位を示す)の偽回文配列をもつ22bpの二本鎖DNAを特異的に認識する.I-ApeII遺伝子にerror-prone PCRによりランダム変異を導入後,DNAシャッフリング法により変異体ライブラリーを多様化した.22bpの認識配列の両端の5bpずつを欠失したDNA配列(12bp)を含む基質RS14を用いて約750変異体からスクリーニングした結果,6個の変異体において二本鎖DNA切断活性をもつことを見い出した.変異体のDNA切断部位は,野生型のそれと同一であった.その中でRS14に対する最大の比活性を示した変異体PL02-07Dは,Val1からGly101までの領域にアミノ酸残基置換はなかったものの,Phe102以降の66アミノ酸残基(すなわちC末端部分の約1/3)が欠失していた.PL02-07Dのアミノ酸配列から立体構造モデルを構築したところ,LAGLIDADG型HEaseに共通するコア構造αββαββαを含むと予測された.PL02-07Dにおける欠失部位は,DNA結合面であるβサドルの裏打ち構造となる3本のαヘリックスの領域に相当する.上記の変異によりβサドルの辺縁部の構造柔軟性が高まり,標的DNA配列の認識機能に差異が生じたものと考えられた.

LAGLIDADG-type DNA sequencing enzyme (HEase) 14 ~ 40bp long This year, we aim to understand HEase target DNA sequence and specify its functional structure. We aim to introduce HEase, I-Ape II gene sequence and analyze its different phenotypes, including those of HEase, I-Ape II gene. As a result, the length of the recognition sequence in the wild type has been shortened and the variation has been successful. Wild-type I-ApeII 5'-CTGACTCTC^TTAA*GGTAGCCAA (* DNA sequence analysis showed that there were about 750 different DNA sequences at the end of 22 bp sequence, and 6 different DNA sequences at the end of 22 bp sequence. The mutant DNA cut site is opposite to the wild type. The maximum specific activity of RS14 in the middle of the reaction was shown by allogeneic PL02 - 07D,Val1, Gly101, and 66 amino acid residues in the middle of the reaction.(About 1/3 of the terminal part of PL02 - 07D) is missing. PL02 - 07D has a common structure αβ α β α, including a predicted structure. PL02 - 07D has a missing part, a DNA binding surface β α β α βα, and a corresponding domain. The structural flexibility of the β-part of the target DNA is high, and the cognitive function of the target DNA is different.