古細菌ゲノムの体系的・網羅的機能解析を支援する逆遺伝学的方法論の開発

开发反向遗传方法以支持古菌基因组的系统和全面的功能分析

基本信息

批准号：
12206047
负责人：
野村紀通
金额：
--
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (C)
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12206047/
关键词：
古細菌逆遺伝学遺伝子破壊超好熱菌イントロンホーミング

项目摘要

1.ピリミジン生合成系遺伝子のうちのpyrFEを選択遺伝マーカーとして利用する系を確立した.in silico解析からゲノム上にpyrB,pyrC,pyrO,pyrE(URA5),pyrF(URA3)が存在し,ピリミジン生合成がオロト酸を代謝中間体として経由すると推測された.また,オロト酸の類似体5-フルオロオロト酸(5-FOA)を180μg/mlの濃度で合成培地に添加すると,90℃において古細菌Aeropyrum pernix野生株の増殖が完全に阻害された.さらに,野生株にUVを照射してpyrEまたはpyrFにナンセンス変異を導入した変異株では5-FOA耐性/ウラシル要求性の表現型が現れることが確認された.以上から,pyrFEを選択遺伝マーカーとして用いて5-FOA耐性/感受性あるいはウラシル要求性の有無によって,pyrFE変異株と野生株を選別できることが示された.2.染色体DNAと部分的に相同領域を有する線状DNA断片を古細菌細胞に導入し,相同組み換え能を利用して標的遺伝子をワンステップで破壊する手法を確立した.pyrFEコード領域の大部分を欠失し,相同領域としてpyrFEの5'および3'隣接領域をもつ線状DNA断片をin vitroで作製し,M.HaeIIIメチラーゼでメチル化後,エレクトロポレーションによりA.pernix野生株細胞に導入した.90℃の高温でも融解しないGellan Gumプレート培地上で5-FOA耐性となったコロニーを選択した結果,pyrFE欠失株 K121(ΔpyrFE)を得た.また,既にゲノム配列情報から機能推定ができているORFのうち任意に選んだ14個(例えば,recA/RAD51ホモログであるradA[APE0119]など)について,コード領域にpyrFE遺伝子マーカーを挿入したDNA断片をK121(ΔpyrFE)株に導入後,ウラシル不含培地に生育するクローンとして破壊株を分離した.これら各破壊株についててはPCRやサザン分析で遺伝子破壊を確認するとともに表現型の解析も行った.

1。建立了一个系统，该系统在嘧啶生物合成基因中使用pyrfe作为选择性遗传标记。在基因组上，从中硅分析中，pyrb，pyrc，pyro，pyre（ura5）和pyrf（ura3）存在，并且估计嘧啶的生物合成估计将原子酸用作代谢中间体。此外，当在180μg/ml的浓度下，将Orotonic Acid 5-氟甲酸（5-FOA）的类似物添加到合成培养基中，即在90°C下的古细菌。 pernix野生菌株的生长被完全抑制。此外，已经证实，在突变体中出现了5-FOA耐药性/尿嘧啶需要的表型，这些表型出现在已通过野生菌株的紫外线照射引入Pyre或Pyrff中。从这些结果中可以证明，可以根据5-FOA抗性/敏感性或尿嘧啶需要的pyrfe突变体和野生菌株选择2。我们引入了线性DNA片段，具有与染色体DNA同源性区域的线性DNA片段中，并使用了一步中破坏靶基因的能力。我们删除了大多数Pyrfe编码区域，并使用同源区域将Pyrfe的5'和3'侧翼区域作为同源区域注入线性DNA片段。在体外制备细胞，并用HaEIII甲基甲基甲基甲基甲基化，然后通过电穿孔引入A. pernix野生线细胞中。选择了对gellan胶板培养基上5-FOA具有抗性的菌落，即使在90°C的高温下也没有融化，结果是它们能够抗Pyrfe。获得K121（ΔPyrfe）。此外，从基因组序列信息（例如RADA [APE0119]，RECA/RAD51同源物等）中进行了功能估算的14个ORF，将插入编码区域的pyrfe Gene标记物引入K121（ΔPyrfe）中的介质和介质中的媒介中，将pyrfe Gene标记物引入了介绍的DNA片段。对于这些干扰菌株，通过PCR和南部分析证实了基因破坏，并进行了表型分析。