古細菌ゲノムの体系的・網羅的機能解析を支援する逆遺伝学的方法論の開発

开发反向遗传方法以支持古菌基因组的系统和全面的功能分析

• 批准号: 12206047
• 负责人: 野村 紀通
• 金额: --
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (C)
• 财政年份: 2000
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2000 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12206047/
• 关键词: 古細菌; 逆遺伝学; 遺伝子破壊; 超好熱菌; イントロン; ホーミング

1.ピリミジン生合成系遺伝子のうちのpyrFEを選択遺伝マーカーとして利用する系を確立した.in silico解析からゲノム上にpyrB,pyrC,pyrO,pyrE(URA5),pyrF(URA3)が存在し,ピリミジン生合成がオロト酸を代謝中間体として経由すると推測された.また,オロト酸の類似体5-フルオロオロト酸(5-FOA)を180μg/mlの濃度で合成培地に添加すると,90℃において古細菌Aeropyrum pernix野生株の増殖が完全に阻害された.さらに,野生株にUVを照射してpyrEまたはpyrFにナンセンス変異を導入した変異株では5-FOA耐性/ウラシル要求性の表現型が現れることが確認された.以上から,pyrFEを選択遺伝マーカーとして用いて5-FOA耐性/感受性あるいはウラシル要求性の有無によって,pyrFE変異株と野生株を選別できることが示された.2.染色体DNAと部分的に相同領域を有する線状DNA断片を古細菌細胞に導入し,相同組み換え能を利用して標的遺伝子をワンステップで破壊する手法を確立した.pyrFEコード領域の大部分を欠失し,相同領域としてpyrFEの5'および3'隣接領域をもつ線状DNA断片をin vitroで作製し,M.HaeIIIメチラーゼでメチル化後,エレクトロポレーションによりA.pernix野生株細胞に導入した.90℃の高温でも融解しないGellan Gumプレート培地上で5-FOA耐性となったコロニーを選択した結果,pyrFE欠失株 K121(ΔpyrFE)を得た.また,既にゲノム配列情報から機能推定ができているORFのうち任意に選んだ14個(例えば,recA/RAD51ホモログであるradA[APE0119]など)について,コード領域にpyrFE遺伝子マーカーを挿入したDNA断片をK121(ΔpyrFE)株に導入後,ウラシル不含培地に生育するクローンとして破壊株を分離した.これら各破壊株についててはPCRやサザン分析で遺伝子破壊を確認するとともに表現型の解析も行った.

1. PyrB, PyrC, PyrO,PyrE(URA5), PyrF(URA3) were found to be the metabolic intermediates in the biosynthesis system. 5-FOA (5-FOA), an analogue of 5-FOA, was added to the synthetic culture at a concentration of 180μg/ml. At 90 ℃, the growth of wild strains of archaea Aeropyrum pernix was completely inhibited. The wild plants were exposed to UV light and the 5-FOA tolerance/phenotype was confirmed. 2. Chromosome DNA and linear DNA fragments in the same domain were introduced into archaeal cells. The same group of DNA fragments can be used to identify the target DNA fragments. Most of the regions of the pyramid are missing. The same regions of the pyramid are 5'and 3' adjacent regions. Linear DNA fragments are produced in vitro. M.HaeIII is used to identify DNA fragments. A.pernix wild strain was introduced into the culture medium at 90 ℃ and thawed at 90 ℃. 5-FOA tolerance was obtained. PyrFE deficient strain K121(ΔpyrFE) was selected. In addition, 14 ORFs (e.g.,recA/RAD51) were randomly selected from among the 14 ORFs (e.g.,recA/RAD51). After introduction of DNA fragment K121(ΔpyrFE) strain into the field, the ORFs were isolated without culture. This is the first time that we have analyzed the phenotype of each plant.

项目成果

Tachibana,A. et al.: "Novel prenyltransferase gene encoding farnesylgeranyl diphosphate synthase from a hyperthermophilie archaeon Aeropyrum peruix."European Journal of Biochemistry. 267・2. 321-328 (2000)

Tachibana, A. 等人：“编码来自超嗜热古细菌 Aeropyrum peruix 的新型异戊烯基转移酶基因”。欧洲生物化学杂志 267・2 (2000)。

野村紀通 ら: "月刊海洋No.23号外(特集「海洋微生物」)"海洋出版株式会社. 263 (2000)

野村纪道等：《月刊海洋第23期特辑（特辑“海洋微生物”）》海洋出版有限公司263（2000）

Sako,Y. et al.: "Bergey's Manual of Systematic Bacteriology (2nd Ed.)"Springer-Verlag(印刷中). (2001)

Sako, Y. 等人：“Bergey 的系统细菌学手册（第二版）”Springer-Verlag（印刷中）。