DNAポリメラーゼβとその新規特異的阻害天然物の結合の立体構造的研究

DNA聚合酶β及其新型特异性抑制天然产物结合的三维结构研究

• 批准号: 12780442
• 负责人: 水品 善之
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: Kobe Gakuin University (2001)Tokyo University of Science (2000)
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 2000
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2000 至 2001
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-12780442/
• 关键词: 酵素特異的阻害剤; DNAポリメラーゼβ; 長鎖脂肪酸; リトコール酸; 糖脂質; 2次元NMR解析; 立体構造解析; 特異的阻害物質; 分子プローブ; 有機化学合成; DNA複製・修復

1.DNAポリメラーゼβ・8kDaドメインの大量発現DNAポリメラーゼβ(polβ)・8kDaドメイン遺伝子のN末側にHis-タグを挿入して、その遺伝子を大腸菌へ組み込んだ。そして大腸菌を培養して遺伝子を発現させて、ニッケルカラムで簡単にかつ大量に8kDaドメインを供給することに成功した。培地に^<15>NH_4Clを添加して蛋白質を安定同位体ラベルすることにより、2次元NMR測定用の8kDaドメインサンプルを提供できるようにした。2.DNAポリメラーゼβ・8kDaドメインと阻害剤の2次元HMQC-NMR解析長鎖脂肪酸のリノール酸およびネルボン酸、胆汁酸ステロイドであるリトコール酸がpolβ・8kDaドメインの一本鎖DNA結合活性を阻害したので、阻害剤の8kDaドメインへの結合を^1H-^<15>N HMQC-NMRで解析した。長鎖脂肪酸は8kDaドメインのLeu11,Lys35,His51,Thr79と、リトコール酸はLys60,Leu77,Thr79と結合することを見いだした。長鎖脂肪酸・リトコール酸ともにカルボキシル基を有しており、カルボキシル基がLys残基と水素結合することが考察された。3.糖脂質(Sulfo-quinovosyl-monoacyl-glycerol, SQMG)の化学合成長鎖脂肪酸よりも10倍以上強くpolβを阻害する糖脂質(SQMG)の有機化学合成に成功した。また各種類似体・誘導体合成にも成功して、阻害剤の構造活性相関を明らかにした。SQMGと8kDaドメインの結合のNMR解析を現在実施している。4.DNAポリメラーゼβ・8kDaドメインの変異蛋白質の作製遺伝子工学的手法を用いて、長鎖脂肪酸およびリトコール酸が結合する上述の8kDaドメインのアミノ酸残基をAlaに変異させた蛋白質の作製に成功した。阻害剤の変異蛋白質への結合について、野生型(非変異型)との比較はこれから実施するところである。

1. DNA ポ リ メ ラ ー ゼ beta · 8 kda ド メ イ ン の large 発 now DNA ポ リ メ ラ ー ゼ beta (pol beta), 8 kda ド メ イ ン heritage 伝 の N at the end of the lateral に His son - タ グ を scions into し て, そ の heritage 伝 son を coliform group へ み 込 ん だ. そ し て coliform を cultivate し て posthumous son 伝 を 発 now さ せ て, ニ ッ ケ ル カ ラ ム で Jane 単 に か つ large に 8 kda ド メ イ ン を supply す る こ と に successful し た. The petty に ^ < 15 > NH_4Cl を add し て protein を stable isotopic body ラ ベ ル す る こ と に よ り, 2 dimensional NMR measurement with の 8 kda ド メ イ ン サ ン プ ル を provide で き る よ う に し た. 2. DNA ポ リ メ ラ ー ゼ beta · 8 kda ド メ イ ン と resistance against two tonic の yuan HMQC - NMR analytical long locks fatty acids の リ ノ ー ル acid お よ び ネ ル ボ ン acid and bile acid ス テ ロ イ ド で あ る リ ト コ ー ル acid が pol beta · 8 kda ド メ イ ン の a lock DNA binding activity を resistance against し た の で, resistance against tonic の 8 kda ド メ イ <s:1> へ へ へ is combined with を^1H-^<15> NHMQC-NMR で to resolve た た. Long locks fatty acids は 8 kda ド メ イ ン の Leu11, Lys35, His51, Thr79 と, リ ト コ ー ル acid は Lys60, Leu77, Thr79 と combining す る こ と を see い だ し た. Long locks, fatty acids リ ト コ ー ル acid と も に カ ル ボ キ シ ル を has an し て お り, カ ル ボ キ シ ル base が Lys residue と water element combination す る こ と が investigation さ れ た. 3. The chemical synthesis of glycolipids (Sulfo-quinovosyl-monoacyl-glycerol, SQMG) <s:1> with long-lock fatty acids よ <s:1> <s:1> <s:1> more than 10 times the strong くpolβを hindering the organic chemical synthesis of する glycolipids (SQMG) <e:1> に successfully た. Youdaoplaceholder0 various analogues and inducers were synthesized. Youdaoplaceholder1 また was successfully synthesized. <s:1> て, and the active phase related to the construction of the inhibitor <s:1> was を clear. Youdaoplaceholder4 に に た た. SQMGと8kDaドメ ドメ て <s:1> combined with <s:1> NMR analysis を current implementation て る る る. 4. DNA ポ リ メ ラ ー ゼ beta · 8 kda ド メ イ ン の - but the different protein の cropping 伝 sub engineering technique を with い て, long locks fatty acid お よ び リ ト コ ー ル acid が す る の above 8 kda ド メ イ ン の ア ミ ノ acid residues を Ala に - different さ せ た protein の cropping に successful し た. The inhibitory agent <s:1> variant protein へ <s:1> binds に すると て て て て て and wild-type (non-variant type)と <e:1> to compare the actual application of <s:1> れ れ ら ら すると ろである ろである.

项目成果

S.Hanashima et al.: "Structure determination of sulfoquinovosyldiacylglycerol by chiral syntheses"Tetrahedron lett.. 41. 4403-4407 (2000)

S.Hanashima 等人：“通过手性合成测定磺基奎诺基二酰基甘油的结构”Tetrahedron lett.. 41. 4403-4407 (2000)

花島慎弥: "Structural determination of sulfoquinovosyldiacylglycerol by chiral syntheses"Tetrahedron Letters. 41. 4403-4407 (2000)

Shinya Hanajima：“通过手性合成测定磺基奎诺基二酰基甘油”Tetrahedron Letters 41. 4403-4407 (2000)。

Y.Mizushina et al.: "Three-dimensional structural model analysis of the binding site of lithocholic acid, an inhibitor of DNA polymerase β and DNA topoisomerase II"J.Biochem.(Tokyo). 130. 657-664 (2001)

Y.Mizushina 等人：“DNA 聚合酶 β 和 DNA 拓扑异构酶 II 抑制剂石胆酸结合位点的三维结构模型分析”J.Biochem.（东京）130. 657-664（2001）。

水品善之: "Dehydroaltenusin, a Mammalian DNA polymerase α Inhibitor"J.Biol.Chem.. 275. 33957-33961 (2000)

Yoshiyuki Mizushina：“脱氢altenusin，一种哺乳动物DNA聚合酶α抑制剂” J.Biol.Chem.. 275. 33957-33961 (2000)

水品善之: "Structural Homology Between DNA Binding Site of DNA polymerase β and DNA Topoisomerase II"J.Mol.Biol.. 304. 385-395 (2000)

Yoshiyuki Mizushina：“DNA 聚合酶 β 的 DNA 结合位点与 DNA 拓扑异构酶 II 之间的结构同源性” J.Mol.Biol.. 304. 385-395 (2000)