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バキュロウイルス感染細胞を利用した無細胞蛋白質生産系の構築

使用杆状病毒感染的细胞构建无细胞蛋白质生产系统

基本信息

批准号：
13876014
负责人：
小林淳
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Mie University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至 2002
项目状态：
已结题

项目摘要

バキュロウイルス感染細胞から翻訳後修飾が可能な無細胞蛋白質生産系を構築するための基礎的技術開発を目的として、N型糖鎖付加修飾反応に焦点を絞り、まず使用する昆虫細胞の選定を行った。組換え糖蛋白質(PTTH)を数種バキュロウイルスベクター系で発現させ、付加される糖鎖の主要な構造をレクチンブロットなどで比較検討したところ、High Five細胞では、アレルゲンとなるコアα1,3フコースの分岐が比較的多いことと、サクサン細胞ではわずかに複合型糖鎖の付加がおこるなど若干の細胞間差異があるものの、いずれの鱗翅目昆虫細胞でも末端マンノースとコアα1,6フコースの分岐を有する構造が主体であった。そこで、ウイルスと細胞の両方のゲノム情報が最も豊富なカイコ核多角体病ウイルス(BmNPV)とBmN4細胞を実験材料に供試して研究をすすめることにした。その手始めとしてDNAマイクロアレイを使用して、BmN4細胞と別のカイコ培養細胞BoMoの遺伝子発現パターンを網羅的に比較したところ、想像以上に多くの違いが認められ、この違いが細胞株間の翻訳後修飾特性の差を生み出していると考察された。BmNPVにおけるvery lateプロモーターからの糖蛋白質生産パターンの解析を容易にするために、バキュロウイルスにおける生産効率の高いラブドウイルスIHNVの表面膜糖蛋白質遺伝子の膜結合領域以降をコードする配列をヘキサヒスチジンタグ配列に置換したcDNAを作製し、BmNPV感染BmN4細胞で発現させたところ、分泌されずにゴルジ体で不溶化することが、糖鎖構造の解析と共焦点顕微鏡による免疫組織化学で明らかになった。この不溶化回避に有効な分子シャペロンの探索が今後の無細胞蛋白質生産系構築に必要な課題として残された。

The selection of insect cells for the purpose of developing basic techniques for the construction of cell-free protein production lines by post-translational modification of infected cells and N-type carbohydrate chains plus modification of the target cells. The composition of glycoproteins (PTTH) is a variety of different types of glycoproteins. The main structures of glycoproteins are found in different cell types, such as High Five cells, and high Five cells. The structure of the terminal part of a lepidopteran insect cell is called the "structure of the body." The most abundant information on the development of nuclear polyhedrosis (BmNPV) and BmN4 cells is available for testing. A comparison of the results of DNA sequencing in BmN4 cells and the results of DNA sequencing in BmN4 cells and BmN4 cells was made. BmNPV is very late in protein production and easy to analyze. It has high productivity and high binding efficiency. The membrane binding domain of IHNV's surface membrane glycoprotein gene is replaced by cDNA in the domain of protein binding. BmNPV infection in BmN4 cells is detected and secreted. Immunohistochemical analysis of glycogen lock structure and confocal microscopy This article discusses how to avoid the problem of molecular evolution and how to construct cell-free protein production system in the future.