GM-CSF受容体ノックアウトマウスからの樹状細胞培養法の確立

GM-CSF受体敲除小鼠树突状细胞培养方法的建立

• 批准号: 13877193
• 负责人: 木村 廣光
• 金额: $ 0.45万
• 依托单位: National Research Institute for Child Health and Development
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 2002
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-13877193/
• 关键词: 造血幹細胞; 血液幹細胞; 樹状細胞; サイトカイン; GM-CSF; IL-4; GM-CSF受容体; Flt3; Flk2; GM-CSFノックアウトマウス; GM-CSF受容体ノックアウトマウス

本年度の研究では,(1)GM-CSF受容体ノックアウトマウス並びにGM-CSFノックアウトマウスの骨髄細胞を用い,ヒトFlt3/Flk2リガンド並びにヒトIL-6にて2週間の初期培養を行い,その後マウスTNFαを更に添加し,GM-CSF非依存性樹状細胞の誘導と長期大量培養法を確立した。樹状細胞純化の為の分離システムとして,AutoMACS(自動磁気分離装置)を用い,CD11c或いはCD80,CD86などの,樹状細胞マーカーにて,分離後FACS解析及び細胞染色によって,純化精度を検討した。CD11c或いは,CD80,CD86標識細胞を分離精製した細胞は,ほぼ70%程度樹状細胞を含むが,ラット骨髄細胞から同様の培養方法にて,誘導した樹状細胞群をNKR-P1A (CD161)にて,分離精製した,ほぼ均一な樹状細胞とは,明らかに異なり,マクロファージを含む不均一な細胞からなる事が,判明した。従来の報告と異なり,これらCD11c, CD80,CD86のマーカーのみにては,樹状細胞の完全な分離は出来ないものと考えられた。(2)蛍光蛋白(EGFP)遺伝子導入マウスの骨髄細胞を用い,上記培養方法を応用して,樹状細胞の蛍光蛋白発現強度をFACS解析及び細胞染色法にて,検討を行った所,培養成熟樹状細胞では,末梢血リンパ球,多核白血球と異なり,ほぼ完全に蛍光蛋白が減弱ないし消失する事が判明した。(3)各種遺伝子ヴェクター(アデノウィルス・レンチウィルス・HVJ)を用いた遺伝子導入系に於いて,成熟樹状細胞への遺伝子導入は極めて困難である事が明らかとなった。今後,樹状細胞への遺伝子導入と,感染免疫或いは腫瘍免疫への実験・臨床応用には,更に検討が必要である。

This year's study included: (1) The use of GM-CSF receptor and GM-CSF receptor in bone marrow cells, Flt3/Flk2 expression and IL-6 expression during initial culture for 2 weeks, and subsequent addition of TNFα, establishing a method for induction and long-term mass culture of GM-CSF-independent dendritic cells. For the purification of dendritic cells,AutoMACS(Automatic Magnetic Separation System) was used. CD11c or CD80 or CD86 was used. Dendritic cells were purified. FACS analysis and cell staining after separation were carried out. Purification accuracy was evaluated. CD11c or CD80, CD86 labeled cells were isolated and purified. Dendritic cells were induced to NKR-P1A (CD161). Dendritic cells were isolated and purified. Dendritic cells were isolated and purified. The tree cells were completely separated from each other. (2)The expression of EGFP gene in dendritic cells was analyzed by FACS and cell staining method. The results showed that EGFP gene expression in mature dendritic cells was reduced and disappeared completely. (3)All kinds of genetic vectors are introduced into mature dendritic cells. It is very difficult to introduce genetic vectors into mature dendritic cells. In the future, dendritic cell gene transfer, infection immunity or tumor immunity, clinical use, more research is necessary.

项目成果

Fujino M, Li XK, Guo L, Kitazawa Y, et al.: "T-cell apoptosis triggered by FTY72O via mitochondrial pathway"Transplant Proc. 33(7-8). 3084-3085 (2001)

Fujino M、Li XK、Guo L、Kitazawa Y 等：“FTY72O 通过线粒体途径触发 T 细胞凋亡”移植程序。

Yano Y, Hara M, Miyahara T, et al.: "Microchimeric cells from the peripheral blood associated with cardiac grafts are bone marrow derived, long-lived and maintain acquired tolerance to minor histocompatibility antigen H-Y"Transplantation. 71(10). 1456-146

Yano Y、Hara M、Miyahara T 等人：“来自与心脏移植物相关的外周血的微嵌合细胞是骨髓来源的，寿命长，并保持对次要组织相容性抗原 H-Y 的获得性耐受”移植。

Adachi K, Li X, Kimura H, et al.: "Prolonged survival of rat liver allografts with CrmA gene transfer"Transplant Proc. 33(1-2). 605 (2001)

Adachi K、Li X、Kimura H 等人：“通过 CrmA 基因转移延长大鼠同种异体肝脏移植物的存活”移植程序。

Adachi K, Li X, Kimura H, et al.: "HIV-1 Nef protein prolonged recipient survival in rat liver allografting"Transplant Proc. 33(1-2). 284 (2001)

Adachi K、Li X、Kimura H 等人：“HIV-1 Nef 蛋白延长了大鼠同种异体肝脏移植中受体的存活率”移植过程。

H.Yan, T.Miyagi, E.Satoh, Y.Nagata, X-Kli, H.Kimura: "Generation of a large number of myeloid dendritic cells (DC) from GM-CSF receptor knockout mouse and its selection by CD 161"Transplantation. (in press).

H.Yan、T.Miyagi、E.Satoh、Y.Nagata、X-Kli、H.Kimura：“GM-CSF 受体敲除小鼠产生大量骨髓树突状细胞 (DC) 及其通过 CD 161 进行选择