ミトコンドリアにおける異性化アミノ酸含有蛋白質の代謝機構の解明

阐明线粒体中异构化氨基酸蛋白的代谢机制

• 批准号: 15657030
• 负责人: 木野内 忠稔
• 金额: $ 2.11万
• 依托单位: Kyoto University (2004-2005)Jichi Medical University (2003)
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2003
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2003 至 2005
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15657030/
• 关键词: D-アミノ酸; D-アスパラギン酸; 活性酸素; ミトコンドリア; 老化; 酸化ストレス; プロテアーゼ; フォールディング病; アルツハイマー病; 活性酵素

ミトコンドリアにおけるD-Asp含有蛋白質の動態を調査するため、D-Asp含有ペプチドを抗原として特異的な抗体(以下、抗D-Asp抗体)を作成し、二次元電気泳動とウエスタンブロッティングにより、その網羅的検出を試みた。まず、通常培養のHep G2(ヒト肝癌由来株細胞)からミトコンドリアを分離し、そのホモジェネートに対して検出を行った。その結果、予想外に陽性スポットが多く検出された(〜40個)。当初、酸化ストレスを与えない限り、蛋白質中のAsp残基のラセミ化は起きにくいと考えていたので、この結果は、作成した抗D-Asp抗体の特異性に疑問をもたせるものであった。従って、別途精製したD-Asp含有蛋白質分解酵素:D-aspartyl endopeptidase(DAEP)をその抽出液に加え、スポットの減少を観察した。なぜなら、DAEPはD-Asp含有蛋白質を特異的に分解するので、DAEPを加えたミトコンドリア抽出液では、D-Asp含有蛋白質が分解され、抗D-Asp抗体では検出できなくなるはずだからである。その結果、およそ半分のスポットが減少した。従って、得られた抗D-Asp抗体陽性スポットの全てがD-Asp含有蛋白質ではないことが判明した。しかしながら、多くの陽性スポットが、DAEPの添加によって消失する、即ち、D-Asp含有蛋白質であることが示唆されたことも確かである。D-Asp含有蛋白質の網羅的な検索方法は、効率や感度の点から本法をおいて他に無い。従って、上述のように抗D-Asp抗体とDAEPと組み合わせて検出すれば、判断を誤ることなくD-Asp含有蛋白質の同定も可能であろう。今後は本法の検出精度をより高め、ストレスの有無によるD-Asp含有蛋白質の生成量の変化について調査したいと考えている。

ミ ト コ ン ド リ ア に お け る D - Asp dynamic を contains proteins の survey す る た め, D - Asp contain ペ プ チ ド を antigen と し て specific な antibodies (" を, D - resistant Asp antibody) made し bathing, secondary yuan electric 気 と ウ エ ス タ ン ブ ロ ッ テ ィ ン グ に よ り, そ の snare 検 out を try み た. ま ず, usually develop の Hep G2 (ヒ ト origin strains of liver cancer cells) か ら ミ ト コ ン ド リ ア を separation し, そ の ホ モ ジ ェ ネ ー ト に し seaborne て 検 を row っ た. The results of そ そ are as follows: に is positive, スポットが is more than く検 is された(~ 40). At the beginning, acidification ス ト レ ス を and え な い り, protein in the limited の Asp residue の ラ セ ミ change since は き に く い と exam え て い た の で, こ の results は, consummate し た D - resistant の Asp antibody specificity に doubt を も た せ る も の で あ っ た. Youdaoplaceholder0, refined by other means たD-Asp contains protein-decompositing enzyme :D-aspartyl endopeptidase(DAEP)をそ the extract of に is added with え, and スポット is reduced by を観. Observe た. な ぜ な ら, DAEP は D - Asp contains proteins を specific に decomposition す る の で, DAEP を plus え た ミ ト コ ン ド リ ア extract で は, D - Asp contains proteins が decomposition さ れ, D - Asp antibody で は 検 out で き な く な る は ず だ か ら で あ る. Youdaoplaceholder0 そ result, およそ half a cent <s:1> スポットが reduces た た. Youdaoplaceholder0, obtaining られた anti-d-asp antibody positive スポット all てがD-Asp contains protein で な な な とが とが とが indicates た. し か し な が ら, multiple く の positive ス ポ ッ ト が, DAEP の add に よ っ て disappear す る, namely ち, D - Asp contains proteins で あ る こ と が in stopping さ れ た こ と も か indeed で あ る. D-Asp contains protein snares. The な検 cable method, efficacy や, sensitivity <s:1> point ら ら method をお て て it に has no な検. 従 っ て, the above の よ う に D - resistant Asp antibody と DAEP と group み close わ せ て 検 out す れ ば, judgment を mistakenly る こ と な く D - Asp with fixed も may contain protein の で あ ろ う. Future は provisions の 検 out precision を よ り め, ス ト レ ス の presence of に よ る D - Asp contains proteins の generation の variations change に つ い て survey し た い と exam え て い る.

项目成果

D-アスパラギン酸含有タンパク質の生成機構とその分解酵素による抗老化機構について

关于含D-天冬氨酸蛋白质的产生机制及其降解酶的抗衰老机制

• 发表时间: 2005
• 期刊: 基礎老化研究 29(1)
• 作者: 木野内忠稔;藤井紀子;香川靖雄;浜本敏郎
• 通讯作者: 浜本敏郎

哺乳類におけるD-アミノ酸の動態とその重要性

D-氨基酸的动态及其在哺乳动物中的重要性

• 发表时间: 2005
• 期刊: 蛋白質 核酸 酵素 50
• 作者: Kaori Kurashima-Ito;Kaori Kurashima-Ito;木野内忠稔
• 通讯作者: 木野内忠稔

老化タンパク質中のD-アスパラギン酸の生成機構とその修復

衰老蛋白中D-天冬氨酸的产生机制及其修复

• 发表时间: 2005
• 期刊: ファルマシア 41
• 作者: 藤井紀子

Mammalian D-aspartyl endopeptidase : a scavenger for noxious racemized proteins in aging

哺乳动物 D-天冬氨酰内肽酶：衰老过程中有害外消旋蛋白的清道夫

• 发表时间: 2005
• 期刊: Viva Origino 33(2)
• 作者: Rieko Kinouchi;Tadatoshi Kinouchi
• 通讯作者: Tadatoshi Kinouchi

Distribution of CESP-1 protein in the corneal endothelium and other tissues

• DOI: 10.1167/iovs.05-0602
• 发表时间: 2006-04-01
• 期刊: INVESTIGATIVE OPHTHALMOLOGY & VISUAL SCIENCE
• 影响因子: 4.4
• 作者: Kinouchi, R;Kinouchi, T;Yamagami, S
• 通讯作者: Yamagami, S