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トランスジェニックおよび遺伝子ノックアウト住血吸虫の確立とその応用

转基因和基因敲除血吸虫的建立及其应用

基本信息

批准号：
15659102
负责人：
奈良武司
金额：
$ 1.98万
依托单位：
Juntendo University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2004
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究では、マンソン住血吸虫スポロシストへの遺伝子導入に必要な技術基盤の確立を目的として、各種遺伝子導入法の有用性について検討した。平成15年度に引き続き、遺伝子銃を用いた遺伝子導入を試みたが、レポーター遺伝子である緑色蛍光蛋白質(GFP)遺伝子の発現は認められなかった。この結果は、当初発表された、遺伝子導入に成功したという報告(Wippersteg, et al.Mol Biochem Parasitol.2002 120:141-50)と矛盾し、その後別のグループから発表された、遺伝子銃を用いた遺伝子導入ではGFPは検出されないという報告(Heyers, et al.Exp Parasitol.2003 105:174-8)と一致する。遺伝子銃による導入法では、DNAをコートした微小金粒子をスポロシストに打ち込むが、スポロシストは多細胞体のため、金粒子が細胞内部ではなく体腔に移行した場合には発現は期待できず、また、仮に細胞内でレポーター遺伝子が発現したとしても発現レベルが非常に低く、GFPが検出されなかったことが想定される。そこで本年度は、遺伝子銃に加えて、スポロシスト体内に直接をDNAを注入することができるマイクロインジェクション法を用いて遺伝子導入の可能性について検討した。マンソン住血吸虫のtriose phosphate isomerase(TPI)遺伝子のプロモーター領域およびポリ(A)付加領域を含む非翻訳配列でGFP遺伝子を挟み込んだプラスミド(pTPI:GFP)を作製し、in vitroで転換したスポロシストにマイクロインジェクションを行なった。GFP特異的プライマーを用いたPCRにより、GFP遺伝子が確かにスポロシスト体内に導入されたことが確認された。しかしながら、蛍光顕微鏡および共焦点レーザー顕微鏡を用いた観察では、GFP蛍光と自家蛍光の判別が難しく、現在、他のレポーター遺伝子およびプロモーター領域を用いて解析を進めている。本研究結果は、住血吸虫への遺伝子導入が非常に困難であることを改めて示すものである。しかしながら、重要熱帯病の病原体であり、生物学的に未知の部分が多い住血吸虫に対して、分子生物学的・遺伝学的アプローチを可能にするためにも遺伝子導入技法を確立していく必要がある。

The purpose of this study is to establish the necessary technical base for the introduction of Schistosoma japonicum and to investigate the usefulness of various gene introduction methods. In 2015, the introduction of green fluorescent protein (GFP) gene was tested. The results are consistent with those reported in the report on successful gene introduction (Wippersteg, et al. Mol Biochem Parasitol.2002 120:141-50) and conflicting results reported in the report on successful gene introduction (Heyers, et al. Exp Parasitol.2003 105:174-8). The introduction of DNA into the cell is expected to result in a very low level of DNA and GFP in the presence of tiny gold particles in multicellular bodies and in the presence of gold particles migrating within the body cavity of the cell. This year, we will examine the possibility of direct DNA injection into the body using the gene transfer method. The triose phosphate isomerase(TPI) gene of Schistosoma japonicum is contained in the domain A and the domain B. The GFP gene is contained in the domain A and B. GFP gene was confirmed by PCR in vivo. It is difficult to distinguish between GFP fluorescence and self-fluorescence in the field of fluorescence microscopy and confocal microscopy. The results of this study indicate that it is very difficult to introduce Schistosoma japonicum into the host cells. It is necessary to establish the technique of introducing important pathogens, unknown parts of biology, and possible parts of molecular biology.