生命科学データベースに基づく消化器特異的な選択的スプライシングの発癌研究への応用

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1.生命科学データベースの活用と情報の抽出:2004年4月にUniversity of California, Los AngelesのDr.Christopher Leeを日本消化器病学会総会(仙台)に招聘し、生命科学データベースの活用と情報の抽出について共同研究計画を行った。さらに藤渕らの協力により、NCBIなどから公開されている生命科学情報、NCBIの"LocusLink" (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/LocusLink/)において、これまで各遺伝子について登録された複数のメッセンジャーRNAの情報を比較・整列を行った。今後は、Dr.Leeらが報告(Nucleic Acids Research, vol31, 2003)した癌特異的に発現する遺伝子群を候補に特に焦点を絞って、解析を進めていきたい。2.臨床検体における選択的スプライシングの確認:これまで収集を進めてきた当教室の胃癌、大腸癌の外科切除標本の新鮮凍結標本、約40検体から、正常部および腫瘍部の全RNAを抽出、胃癌、大腸癌を含む約50種の癌細胞株からも全RNAを抽出した。対象とする遺伝子群は、Dr.Christopher Leeらと計画を進めた胃癌・大腸癌を中心に、癌組織特異的なsplicing variantsの存在が予測される遺伝子群であるが、特に注目しているのは、BRCA1、CCNDBP1 (cyclin D-type binding-protein 1), JAM1, MRGX MORF-related gene X, SUPT5Hなどである。選択的スプライシングを検出するためには、RT-PCRを主体に解析を進める方針とし、逐次ノザンブロッティング法も考慮することにした。プライマー設計の方針決めには、大変な労力を費やし、片側のプライマーがエクソンをまたぐように2セット以上のRT-PCRプライマーを設計して、それぞれの発現レベルを検出する方針とした。胃、大腸その他の臓器と、コントロールとしての細胞株からの全RNAを用いて比較し、臓器特異的あるいは腫瘍特異的な選択的スプライシングの検出が可能であり、発現量が明確には異ならないものの差が検出できるものには、TaqMan法による定量的RT-PCR法も行っている。この方法で、発現の多様性をデータベース化していきたい。