成熟個体における骨の異所性分化誘導による骨再生に関する基礎的研究

诱导成熟个体异位骨分化进行骨再生的基础研究

基本信息

批准号：
15659446
负责人：
野崎中成
金额：
$ 1.79万
依托单位：
Osaka Dental University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2004
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15659446/
关键词：
骨異所性分化再生

项目摘要

成熟個体において細胞のもつ分化ポテンシャルを利用した再生医療への応用は重要な課題と言える。成熟個体における骨の異所性形成の機序が明らかになれば、その技術は骨再生の用途に応用できると考える。歯髄細胞を用いてin vitroの系で骨への分化過程における遺伝子発現を解析した。ヒト骨髄由来の間葉系幹細胞を骨分化誘導する系を応用してラット歯髄初代培養細胞に対して骨芽細胞・骨への分化誘導を試みた。無機質の集積(石灰化結節)を検出するvon kossa染色と前駆骨芽細胞に対して陽性を示すアルカリフォスファターゼ(ALP)染色を行い、骨分化の指標とした。分化誘導後1,2,3,6週における分化程度を評価した。ALP陽性細胞は1-3週と比べて6週で約50%に減少した。石灰化結節数は1週7.8±0.96個,2週9.0±0.82個,3週12.0±1.41個,6週29.1±2.23個で、分化誘導の前半(1-2週)と比較して6週では約3倍増加し統計的に有意であった(p<0.01)。また、分化誘導後1週と6週で総RNAを調製し骨分化に伴って変動するマーカー遺伝子の定量的発現解析を行った。Colla2(collagen typeI),Bglap(osteocalcin)の増加とAlpl(alkaline phosphatase), Bmp2(bone morphogenetic protein 2)の減少が認められた。骨分化に伴って変動するこれら遺伝子群が骨の異所性分化に関与することが示唆された。一方、ICR系統マウスの肝臓初代培養細胞に対して同様の方法で骨分化誘導を試みた。Parp-1阻害剤DPQおよび5-AIQをIC_<50>の濃度で添加すると分化誘導後6週で石灰化結節形成の亢進が認められた。以上の結果からParp-1の発現低下がマウス肝臓における骨の異所性分化を亢進することが示唆された。

使用细胞在成熟个体中的分化潜力的再生医学应用是重要的问题。一旦阐明了成熟个体中骨异位形成的机制，该技术就可以应用于骨再生应用。使用纸浆细胞在体外系统中分析骨分化过程中的基因表达。我们试图通过应用一种诱导人骨骨髓衍生的间充质干细胞的骨分化的系统，将原代培养的大鼠浆细胞的成骨细胞和骨分化诱导到原代培养的大鼠牙髓中。进行冯·科萨（Von Kossa）染色以检测矿物积累（钙化结节）和碱性磷酸酶（ALP）染色，这些染色显示了前体成骨细胞的阳性结果，可用作骨分化的指标。分化诱导后1、2、3和6周的分化程度得到了评估。与1-3周相比，在6周时ALP阳性细胞在6周时降至约50％。钙化结节的数量为每周7.8±0.96，每周9.0±0.82，每周12.0±1.41个，每周29.1±2.23，这是6周的三倍，与差异诱导的前半部分相比（1-2周），并且具有统计学意义（p <0.01）。此外，在分化诱导后1和6周制备了总RNA，并对随着骨分化波动的标记基因进行定量表达分析。观察到观察到观察到Colla2（胶原I型），BGLAP（骨钙素）和Alpl（碱性磷酸酶）和BMP2（骨形态发生蛋白2）的降低。已经提出，这些基因因骨分化而异，与骨骼异位分化有关。另一方面，我们尝试使用相同的方法在ICR菌株小鼠的原代肝培养细胞上诱导骨分化。以IC_ <50>浓度添加PARP-1抑制剂DPQ和5-AIQ显示出分化诱导后6周时钙化结节形成的增加。以上结果表明，PARP-1的表达降低会增强小鼠肝脏中骨的异位分化。