RNAにおける未知変異検出法の開発

我々はこれまでに、MuファージがDNAの塩基ミスマッチをホットスポットとして転移を起こすことを発見し、その応用としてDNA変異検出法を開発している。本研究課題では、Muが通常転移標的として利用できないDNA:RNAヘテロ二重鎖に対して、塩基ミスマッチ依存的に効率よく転移するという新たな知見を元にRNAにおける未知変異検出法の開発を行なった。反応条件を至適化することで、ミスマッチのないDNA:RNAヘテロ二重鎖や一塩基余ったバルジに対する転移は検出限界以下にすることができた。この反応条件下では、大過剰のミスマッチのないDNA:RNAヘテロ二重鎖存在下においても、ミスマッチに依存的な転移はあまり阻害されなかった。このことは、Mu転移を利用して非常に感度の高い変異検出法が開発できることを示唆するものである。Muは塩基ミスマッチのすべての種類を認識できるが、ミスマッチ周囲の配列によっては認識できない場合があった。RNAへの転移部位はミスマッチから約2塩基5‘側で起きていた。この発見を基に、RNAレベルで塩基置換を検出する方法を開発した。方法の概略は、野生型及び変異型mRNAを逆転写と変性/リアニールによってミスマッチを持つDNA:RNAヘテロ二重鎖に変換し、Muの特異的な転移標的として検出するというものである。この方法について2つの特許を申請中である(昨年度申請分を含む)。また、Mu DNAの塩基配列をPCRプライマーとして用いることにより、変異部位を単離し塩基配列を決定できることを示した。さらに、Mu DNAにビオチンを付加し、転移産物をアビジンビーズで単離することにより、変異RNAが単離できることを示した。

我々はこれまでに、MuファージがDNAの塩基ミスマッチをホットスポットとして転移を起こすことを発見し、その応用としてDNA変異検出法を開発している。本研究課題では、Muが通常転移標的として利用できないDNA:RNAヘテロ二重鎖に対して、塩基ミスマッチ依存的に効率よく転移するという新たな知見を元にRNAにおける未知変異検出法の開発を行なった。反応条件を至適化することで、ミスマッチのないDNA:RNAヘテロ二重鎖や一塩基余ったバルジに対する転移は検出限界以下にすることができた。この反応条件下では、大過剰のミスマッチのないDNA:RNAヘテロ二重鎖存在下においても、ミスマッチに依存的な転移はあまり阻害されなかった。このことは、Mu転移を利用して非常に感度の高い変異検出法が開発できることを示唆するものである。Muは塩基ミスマッチのすべての種類を認識できるが、ミスマッチ周囲の配列によっては認識できない場合があった。RNAへの転移部位はミスマッチから約2塩基5‘側で起きていた。この発見を基に、RNAレベルで塩基置換を検出する方法を開発した。方法の概略は、野生型及び変異型mRNAを逆転写と変性/リアニールによってミスマッチを持つDNA:RNAヘテロ二重鎖に変換し、Muの特異的な転移標的として検出するというものである。この方法について2つの特許を申請中である(昨年度申請分を含む)。また、Mu DNAの塩基配列をPCRプライマーとして用いることにより、変異部位を単離し塩基配列を決定できることを示した。さらに、Mu DNAにビオチンを付加し、転移産物をアビジンビーズで単離することにより、変異RNAが単離できることを示した。