DNAおよびRNAにおける未知変異検出・単離法の開発

我々は、Muファージの転移を利用してDNAの点変異を検出できることを示していたが、実験操作が煩雑なため一般的に用いられるに至っていない。これまで、転移反応は各試料ごとにトランスポゼース(転移酵素)やMu DNAを始め複数の試薬を混合して行なっていたが、この場合転移反応に1時間かかる。そこで我々は転移反応系を改変し、転移反応の律速となっていた転移複合体形成を不活性な状態であらかじめ調整し、そこに活性化緩衝液を加えるようにした。また、反応条件に対する要求性の高い転移複合体形成を予め行なうことで、ミスマッチへの転移特異性を高める実験条件の検討が行えるようになった。その結果、反応時間が5分で良好な結果の得られる、長期保存可能な転移反応系を構築することができた。また、Muが通常転移標的として利用できないDNA : RNAヘテロ二重鎖に塩基ミスマッチ依存的に転移することを発見した。この反応におけるミスマッチ依存性は非常に高く、ミスマッチのないDNA : RNAヘテロ二重鎖に対する転位は検出限界以下であった。Muは塩基ミスマッチのすべての種類を認識できるが、ミスマッチ周囲の配列によっては認識できない場合があった。RNAへの転移部位はミスマッチから約2塩基5'側で起きていた。この発見を基に、RNAレベルで塩基置換を検出/単離する方法を開発した。これは野生型及び変異型mRNAを逆転写と変性/リアニールによってミスマッチを持つDNA : RNAヘテロ二重鎖に変換してMuにより検出するものである。利点は非常に高い特異性と、変異部位に挿入されたMuDNAを利用した変異DNAの単離である。これらについて現在特許を出願している。

我々は、Muファージの転移を利用してDNAの点変異を検出できることを示していたが、実験操作が煩雑なため一般的に用いられるに至っていない。これまで、転移反応は各試料ごとにトランスポゼース(転移酵素)やMu DNAを始め複数の試薬を混合して行なっていたが、この場合転移反応に1時間かかる。そこで我々は転移反応系を改変し、転移反応の律速となっていた転移複合体形成を不活性な状態であらかじめ調整し、そこに活性化緩衝液を加えるようにした。また、反応条件に対する要求性の高い転移複合体形成を予め行なうことで、ミスマッチへの転移特異性を高める実験条件の検討が行えるようになった。その結果、反応時間が5分で良好な結果の得られる、長期保存可能な転移反応系を構築することができた。また、Muが通常転移標的として利用できないDNA : RNAヘテロ二重鎖に塩基ミスマッチ依存的に転移することを発見した。この反応におけるミスマッチ依存性は非常に高く、ミスマッチのないDNA : RNAヘテロ二重鎖に対する転位は検出限界以下であった。Muは塩基ミスマッチのすべての種類を認識できるが、ミスマッチ周囲の配列によっては認識できない場合があった。RNAへの転移部位はミスマッチから約2塩基5'側で起きていた。この発見を基に、RNAレベルで塩基置換を検出/単離する方法を開発した。これは野生型及び変異型mRNAを逆転写と変性/リアニールによってミスマッチを持つDNA : RNAヘテロ二重鎖に変換してMuにより検出するものである。利点は非常に高い特異性と、変異部位に挿入されたMuDNAを利用した変異DNAの単離である。これらについて現在特許を出願している。