权益分类	功能权益	普通用户	{{item.name}}会员
{{category.name}}	{{benefitItem.name}}

DNAおよびRNAにおける未知変異検出・単離法の開発

DNA和RNA未知突变检测和分离方法的发展

基本信息

批准号：
16012236
负责人：
柳原克彦
金额：
$ 3.2万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-16012236/
关键词：
トランスポゾン DNA組換え RNA 突然変異 SNP トランスポゼース

项目摘要

我々は、Muファージの転移を利用してDNAの点変異を検出できることを示していたが、実験操作が煩雑なため一般的に用いられるに至っていない。これまで、転移反応は各試料ごとにトランスポゼース(転移酵素)やMu DNAを始め複数の試薬を混合して行なっていたが、この場合転移反応に1時間かかる。そこで我々は転移反応系を改変し、転移反応の律速となっていた転移複合体形成を不活性な状態であらかじめ調整し、そこに活性化緩衝液を加えるようにした。また、反応条件に対する要求性の高い転移複合体形成を予め行なうことで、ミスマッチへの転移特異性を高める実験条件の検討が行えるようになった。その結果、反応時間が5分で良好な結果の得られる、長期保存可能な転移反応系を構築することができた。また、Muが通常転移標的として利用できないDNA : RNAヘテロ二重鎖に塩基ミスマッチ依存的に転移することを発見した。この反応におけるミスマッチ依存性は非常に高く、ミスマッチのないDNA : RNAヘテロ二重鎖に対する転位は検出限界以下であった。Muは塩基ミスマッチのすべての種類を認識できるが、ミスマッチ周囲の配列によっては認識できない場合があった。RNAへの転移部位はミスマッチから約2塩基5'側で起きていた。この発見を基に、RNAレベルで塩基置換を検出/単離する方法を開発した。これは野生型及び変異型mRNAを逆転写と変性/リアニールによってミスマッチを持つDNA : RNAヘテロ二重鎖に変換してMuにより検出するものである。利点は非常に高い特異性と、変異部位に挿入されたMuDNAを利用した変異DNAの単離である。これらについて現在特許を出願している。

I 々は、Muファージの転movable をutilize してDNA's different points を検出できることをIndicate the operation of the manual and the normal operation of the general manual. Each sample of これまで and 転movable reaction enzyme やMu DNA is the beginning of the plural and the mixture is mixed and the line is the same. The complex formation of the そこで我々は転movable reaction system をchange変し, 転movable reaction 応のtempo and となっていた転shift The inactive state is adjusted and the activation buffer is added and added.また、Reflection condition に対するRequirement の高い転综合 Formation を于め行なうことで、ミスマッチへの転综合を高める実験conditionsの検questionが行えるようになった. The results are good, the reaction time is 5 minutes, the results are good, and the long-term storage is possible. The reaction system is constructed by the reaction system.また、MuがUsing the できないDNA of また、MuがUsually the に転动することを発见した which the RNA ヘテロ double lock に塩基ミスマッチ depends on.この応におけるミスマッチdependenceはveryに高く、ミスマッチのないDNA: RNA ヘテロ double lock に対す転 position は検であった below the limit. Muは塩记ミスマッチのすべてのkindをKnowledgeできるが、ミThe スマッチweek囲のmatching によっては recognizes the できない occasion があった. The RNA transfer site is the same as the base 5' side.この発见をbasedに、RNAレベルで塩塩综合を検出/単利する法を开発した.これは wild type and び変 heterogeneous mRNA を inverse writing と変性/リアニールによってミスマッチをholdつDNA: RNA ヘテロ double lock に変change してMuにより検出するものである. The advantage is that it is very specific and has high specificity, and the MuDNA can be inserted into the different parts and it can be used to isolate the different DNA.これらについて is now licensed as a wish している.