新規高速ポジショナルクローニング法の開発

开发一种新的高速定位克隆方法

• 批准号: 17019040
• 负责人: 柳原 克彦
• 金额: $ 2.24万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2005
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2005 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-17019040/
• 关键词: トランスポゾン; 突然変異; ポジショナルクローニング; SNP; RNA; 転移

我々の本研究課題における目標は、変異した遺伝子をトランスポゾンを用いて選択的に回収するという新たなポジショナルクローニング法を確立することである。この研究課題を遂行するためには、変異遺伝子から転写された変異mRNAが正常な転写産物から作成したcDNAにアニールすることで生じるDNA/RNAヘテロ二重鎖のミスマッチを非常に高い選択性をもって検出/単離できなくてはならない。また、既に合成オリゴDNA/RNAを用いた実験では、すべての種類のDNA/RNAミスマッチがMuの特異的な標的となることを見出していたが、これはある決まった塩基配列中のミスマッチにおける結果であり、様々な配列が存在するゲノム中の変異を全て検出できることを保証するものではない。そこで、まずこれらの点について検討を行なった。線虫のF46H5.3遺伝子(約1.2kb)からRNAを調整し、100塩基ごとにミスマッチを生ずるような合成DNAとアニールさせ、Muによるミスマッチ検出を試みた。その結果、5/10の部位でミスマッチを検出できた。最適化された反応条件下では、短い合成DNA:RNAを試料に使った場合、ノンミスマッチDNA/RNAが200倍過剰に存在してもミスマッチDNA/RNAへの転位にほとんど影響しないことを確認した。さらに、酵母ade-6変異株から調整したトータルmRNAに大過剰の野生型ade-6遺伝子を加え、転移反応後アビジンビーズで回収し、Muプライマーとade-6プライマーでPCRすることによりade-6遺伝子を変異特異的に増幅できる実験条件を設定することができた。以上の知見を踏まえ、分裂酵母野性株とade-6変異株を材料にポジショナルクローニングの実験条件を検討した。種々の工夫により、遺伝子特異的プライマーを用いることなくade-6遺伝子を変異特異的に増幅できるようになった。

This research topic I 々 の に お け る target は, - different し た heritage 伝 son を ト ラ ン ス ポ ゾ ン を with い て sentaku に back 収 す る と い う new た な ポ ジ シ ョ ナ ル ク ロ ー ニ ン を グ method established す る こ と で あ る. こ の research topic を carries out す る た め に は, - different heritage 伝 son か ら planning write さ れ た - different mRNA が normal な product planning write か ら made し た cDNA に ア ニ ー ル す る こ と で raw じ る DNA/RNA ヘ テ ロ double lock の ミ ス マ ッ チ を very high に い sentaku sex を も っ て 検 out / 単 from で き な く て は な ら な い. ま た, both に synthetic オ リ ゴ DNA/RNA を い た be 験 で は, す べ て の kinds の DNA/RNA ミ ス マ ッ チ が Mu の specific な mark と な る こ と を shows し て い た が, こ れ は あ should ま る っ た salt base with column の ミ ス マ ッ チ に お け る results で あ り, others 々 な match column が exist す る ゲ ノ ム in の - different を full て 検 Warranties で で る とを とを とを とを する <s:1> で で な な な で な な な で. Youdaoplaceholder0 そ で, まず れら れら, <s:1> go to に, を and て検 to ask for を. Traces of nematode の F46H5. 3 伝 child (about 1.2 KB) か ら RNA を adjustment し, 100 salt base ご と に ミ ス マ ッ チ を raw ず る よ う な synthetic DNA と ア ニ ー ル さ せ, Mu に よ る ミ ス マ ッ チ 検 try out を み た. The result of そ そ, the 5/10 spot で で ス ッチを検 ッチを検 gives で た た. Under the condition of optimization さ れ た anti 応 で は, short い synthetic DNA, RNA を sample に make っ た occasions, ノ ン ミ ス マ ッ チ DNA/RNA が 200 times turning に exist し て も ミ ス マ ッ チ DNA/RNA へ の planning a に ほ と ん ど influence し な い こ と を confirm し た. さ ら に, ade - 6 - different strains of yeast か ら adjustment し た ト ー タ ル mRNA に greater than turning の wild-type ade - 6 heritage 伝 を plus え, planning to move after the 応 ア ビ ジ ン ビ ー ズ で back 収 し, Mu プ ラ イ マ ー と ade - 6 プ ラ イ マ ー で PCR す る こ と に よ り ade - 6 heritage 伝 son を - different specific に rights of で き る be を 験 conditions Determine する とがで た た. Above の knowledge を tread ま え, divided wild yeast strains と ade - 6 - different strains を material に ポ ジ シ ョ ナ ル ク ロ ー ニ ン グ の be 験 conditions を beg し 検 た. Kind of 々 の time に よ り, but 伝 specific プ ラ イ マ ー を with い る こ と な く ade - 6 heritage 伝 son を - different specific に rights of で き る よ う に な っ た.

项目成果

標的遺伝子中にミスマッチを有する生物のスクリーニング方法

目的基因错配生物体的筛选方法

• 发表时间: 2006