新規高速ポジショナルクローニング法の開発

我々の本研究課題における目標は、変異した遺伝子をトランスポゾンを用いて選択的に回収するという新たなポジショナルクローニング法を確立することである。この研究課題を遂行するためには、変異遺伝子から転写された変異mRNAが正常な転写産物から作成したcDNAにアニールすることで生じるDNA/RNAヘテロ二重鎖のミスマッチを非常に高い選択性をもって検出/単離できなくてはならない。また、既に合成オリゴDNA/RNAを用いた実験では、すべての種類のDNA/RNAミスマッチがMuの特異的な標的となることを見出していたが、これはある決まった塩基配列中のミスマッチにおける結果であり、様々な配列が存在するゲノム中の変異を全て検出できることを保証するものではない。そこで、まずこれらの点について検討を行なった。線虫のF46H5.3遺伝子(約1.2kb)からRNAを調整し、100塩基ごとにミスマッチを生ずるような合成DNAとアニールさせ、Muによるミスマッチ検出を試みた。その結果、5/10の部位でミスマッチを検出できた。最適化された反応条件下では、短い合成DNA:RNAを試料に使った場合、ノンミスマッチDNA/RNAが200倍過剰に存在してもミスマッチDNA/RNAへの転位にほとんど影響しないことを確認した。さらに、酵母ade-6変異株から調整したトータルmRNAに大過剰の野生型ade-6遺伝子を加え、転移反応後アビジンビーズで回収し、Muプライマーとade-6プライマーでPCRすることによりade-6遺伝子を変異特異的に増幅できる実験条件を設定することができた。以上の知見を踏まえ、分裂酵母野性株とade-6変異株を材料にポジショナルクローニングの実験条件を検討した。種々の工夫により、遺伝子特異的プライマーを用いることなくade-6遺伝子を変異特異的に増幅できるようになった。

我々の本研究課題における目標は、変異した遺伝子をトランスポゾンを用いて選択的に回収するという新たなポジショナルクローニング法を確立することである。この研究課題を遂行するためには、変異遺伝子から転写された変異mRNAが正常な転写産物から作成したcDNAにアニールすることで生じるDNA/RNAヘテロ二重鎖のミスマッチを非常に高い選択性をもって検出/単離できなくてはならない。また、既に合成オリゴDNA/RNAを用いた実験では、すべての種類のDNA/RNAミスマッチがMuの特異的な標的となることを見出していたが、これはある決まった塩基配列中のミスマッチにおける結果であり、様々な配列が存在するゲノム中の変異を全て検出できることを保証するものではない。そこで、まずこれらの点について検討を行なった。線虫のF46H5.3遺伝子(約1.2kb)からRNAを調整し、100塩基ごとにミスマッチを生ずるような合成DNAとアニールさせ、Muによるミスマッチ検出を試みた。その結果、5/10の部位でミスマッチを検出できた。最適化された反応条件下では、短い合成DNA:RNAを試料に使った場合、ノンミスマッチDNA/RNAが200倍過剰に存在してもミスマッチDNA/RNAへの転位にほとんど影響しないことを確認した。さらに、酵母ade-6変異株から調整したトータルmRNAに大過剰の野生型ade-6遺伝子を加え、転移反応後アビジンビーズで回収し、Muプライマーとade-6プライマーでPCRすることによりade-6遺伝子を変異特異的に増幅できる実験条件を設定することができた。以上の知見を踏まえ、分裂酵母野性株とade-6変異株を材料にポジショナルクローニングの実験条件を検討した。種々の工夫により、遺伝子特異的プライマーを用いることなくade-6遺伝子を変異特異的に増幅できるようになった。