ヒト少量血液からの対象ゲノム領域クローニング新手法の開発

开发一种从少量人类血液中克隆靶基因组区域的新方法

• 批准号: 16659091
• 负责人: 木村 穣
• 金额: $ 1.66万
• 依托单位: Tokai University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2004
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2004 至 2005
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-16659091/
• 关键词: DNA抽出; ETクローニング; 制限酵素; TAR法; 疾患感受性領域; BAC; 血液; 相同組換え; 微量DNA; II型制限酵素; 巨大DNA領域

本年度は以下の成果を得た。1)血液からのDNA抽出法の検討昨年度はDNA抽出法を中心に検討し、多くの研究室で使用されるQuiagen社のDNA抽出キットに比べ、膜を利用したDNA抽出器は操作時間が約5-10分/検体と非常に短時間ですみ、一年程度冷蔵保存の血液からでも50-100KbのDNAを回収できた。本年度はこれを実践的に応用し、研究室のメンバー10人で再現性のよい結果を得た。医の倫理委員会ですでに承認を受けた研究計画について患者群のDNAについても今後検討する。2)クローニング条件の検討件については、昨年度、大腸菌のETクローニング法におけるクローニング条件の検討し、大腸菌株の選定を行った。当初、非常に期待していた方法であったが、この方法は対象領域が10Kb以上になってくると組換え率が非常に低くなることが判明した。これではETクローニング法のよさが活かせないため、次いで非対称的なcohesive末端を生じる制限酵素を用いる方法をモデルゲノムとして酵母を対象に検討した。約10KbまでのDNA断片について、ゲノムからのdirect cloningを試みたところ、回収したクローンはほぼ全例目的の領域を含んでいた。ヒトゲノムの際はcomplexityが高いため、分子量によるDNA分画等を行わねばならないと思われるが、極めて期待が持てる方法と言える。以上をもとに、今後ますます実用化への道を目指したい。

今年我们取得了以下结果：1）研究去年的DNA提取方法研究，我们专注于DNA提取方法，并将其与Quiagen的DNA提取套件进行比较，该试剂盒用于许多实验室中，基于膜的DNA提取器以每个样本约5-10分钟的时间运行，并能够从血液中恢复50-100 kb的DNA，以获取50-100 kb的DNA。今年，我们实际上应用了这一点，10个实验室成员获得了良好的可重复性结果。医学伦理委员会已经批准的研究计划将来也将被视为患者组的DNA。 2）关于克隆条件，去年我们检查了大肠杆菌的ET克隆方法中的克隆条件，并选择了大肠杆菌菌株。最初，高度预期这种方法，但发现当目标区域达到10KB或更多时，该方法的重组速率变得非常低。这使得不可能使用ET克隆方法，因此我们接下来使用限制酶检查了一种方法，该酶在酵母中产生不对称的内聚末端作为模型基因组。当尝试从基因组进行直接克隆以达到约10 kb的DNA片段时，回收的克隆几乎包含了几乎所有感兴趣的区域。人基因组具有很高的复杂性，因此人们认为必须基于分子量进行DNA分馏，但是可以说这种方法非常有前途。基于上述，我们希望将来采用更实用的方法。

项目成果

Possible roles of zic1 and zic4, identified within the medaka Double anal fin(Da)locus, in dorsoventral patterning of the trunk-tail region(related to the phenotypes of the Da mutant).

zic1 和 zic4 在青鳉双肛鳍 (Da) 基因座中鉴定出的可能作用，在躯干尾部区域的背腹侧模式中（与 Da 突变体的表型相关）。

• 发表时间: 2004
• 期刊: Mechanism of Development 121
• 作者: Otsuka;M.;et al.
• 通讯作者: et al.