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ヒトサイトメガロウイルス感染に必須な宿主細胞遺伝子の遺伝子トラップ法による同定

通过基因捕获法鉴定人巨细胞病毒感染所必需的宿主细胞基因

基本信息

批准号：
16659122
负责人：
井上直樹
金额：
$ 2.18万
依托单位：
National Institute of Infectious Diseases
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至 2005
项目状态：
已结题

项目摘要

1.スプライシングアクセプターとIRES配列の下流にneo遺伝子を配し、loxPを含み転写開始活性がない3'LTRをもつMLV由来のレトロウイルスベクター産生用のプラスミドを構築した。このプラスミドとVSV-G蛋白をコードするプラスミドをMLVのgag-polを産生するパッケージング細胞にトランスフェクトしてレトロウイルスベクターを得た。得られたベクターの力価をHeLa細胞を用いて測定したところ約10^4/mlであったが、CMV感受性細胞であるテロメラーゼ遺伝子により不死化された繊維芽細胞hTERT-BJ1、神経芽種由来細胞株U373MG、及び網膜上皮由来細胞株ARPEでの力価は約10^3/mlと低かった。作製した約10^4の細胞ライブラリーを限界希釈後、96穴プレートにて培養し、いくつかのレプリカを用意した。各ウェルにCMV感染後、CMV産物によりガンシクロビル(GCV)が活性化され感染細胞は死滅することを利用してGCV存在下で培養し生き残る細胞があるかを検討したが、この方法での選択からは変異細胞を得ることができなかった。そこで、LacZを発現するCMV株を感染させ、Xgalによる染色での選択も検討した。その結果、CMVに対して若干感受性が低下したと思われる細胞株を数株得たが、細胞そのものの増殖性が低下し培養が困難なためその後の解析ができなかった。2.CMV実験室株は繊維芽細胞トロピズムを有するが、内皮細胞トロピズムを失っている。一方、新鮮分離株は内皮細胞トロピズムも有する。この差をもたらす宿主因子を検討するために、テロメラーゼ遺伝子を導入し不死化させた臍帯血管内皮細胞を樹立し、内皮細胞トロピズムCMVに対する感受性を確認した。また、CMV感染によりISG54K遺伝子の活性化やIL-6の産生誘導が起こること、staurosporinにより誘導したアポトーシスが抑制されることなどを見出した。

1. The downstream neo gene of the IRES array is matched, loxP is included, and the 3'LTR is included. The MLV is generated from the IRES array. The VSV-G protein is produced by the MLV gag-pol and the VSV-G protein is produced by the VSV-G protein. The results showed that HeLa cells had the highest activity at 10^4/ml, CMV-sensitive cells had the highest activity at 10^3/ml, and the cell line derived from nerve bud, hTERT-BJ1, and epiploic epithelium, ARPE, had the lowest activity at 10^3/ml. About 10^4 cells were cultured and 96 cells were cultured. After each CMV infection, CMV products are activated and infected cells are killed. The method of selecting and killing cells in the presence of GCV is discussed. CMV strain infection, Xgal staining, and selection were discussed. As a result, CMV sensitivity was lower in several cell lines, and cell proliferation was lower in several cell lines. 2. CMV cell line is a kind of cell line that can be used to control the growth of endothelial cells. A square, fresh isolate of endothelial cells. The difference between host factor and host factor is discussed in detail. The sensitivity of host factor to CMV infection is confirmed. The activation of ISG54K gene and the induction of IL-6 production in CMV infection have been demonstrated.