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遺伝子治療用ベクター開発を目標としたヒトヘルペスウイルス-6DNA複製機構の研究

研究人类疱疹病毒6 DNA复制机制，旨在开发基因治疗载体

基本信息

批准号：
07670356
负责人：
井上直樹
金额：
$ 0.77万
依托单位：
国立予防衛生研究所
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1995
资助国家：
日本
起止时间：
1995 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

1.HHV-6DNA複製開始機構の生化学的解析(1)変異を導入したオリゴDNAを用いた競合的ゲルシフト法により、HHV-6のコードするorigin結合蛋白が認識するコンセンスな塩基配列がYGWYCWCCY(Y=C/T,W=A/T)であることを明らかにした。HHV-6とHSV-1の各origin結合蛋白は自らのorigin配列のみと結合した。HSV-1のコードするorigin結合蛋白が認識する配列はYGYTCGCACTであることが報告されているので、コンセンサス配列の6番目と8番目の2残基における差がウイルス特異的なoriginの認識に重要であると考察された。(2)片鎖のみに変異を導入したヘテロオリゴDNAを用いた競合的ゲルシフト法により、origin結合蛋白はDNAヘリックスの片面からorigin配列を認識することを明らかにした。(3)ゲルシフト法とサウスウエスタン法を用いて、HHV-6のorigin結合蛋白の482-770アミノ酸残基の領域がDNA結合ドメインであること、そのうち657-770残基領域がDNAと直接結合するために必須であり、残りの領域は蛋白の立体構造保持に必要と考えられることを見い出した。2.「パッケージング細胞」としてのorigin結合蛋白発現細胞株の作成origin結合蛋白遺伝子を組み込んだ発現プラスミドを構築し、エレクトロポーレーション法によりヒトT細胞に遺伝子導入した。作製した抗体を用いて蛍光抗体法により細胞内での一過性発現を確認した。現在、安定にorigin結合蛋白を発現し続ける細胞株を選択中である。

1. Biochemical Analysis of HHV-6 DNA Replication Initiation Mechanism (1) Different Methods of DNA Replication and HHV-6 Origin-binding Protein Identification: YGWYCWCCY(Y=C/T,W=A/T) HHV-6 and HSV-1 origin binding proteins bind to each other independently. HSV-1 gene sequence and origin binding protein are important for understanding HSV-1 gene sequence and origin specific protein. (2)The DNA sequence of the fragment is different from that of the origin sequence. (3)HHV-6 origin-binding protein residues 482-770 domain DNA binding protein residues 657-770 domain 2. "Origin-binding protein producing cell line" and "Origin-binding protein producing cell line" were used to construct and construct the gene expression system for T cell gene expression. The transient appearance in cells was confirmed by using the light antibody method. Now, stable origin-binding protein is found in cell lines.