器官培養コルチ器を用いたprestinによる蝸牛増幅機構の直接的解析

利用Corti器官培养直接分析Prestin的耳蜗放大机制

• 批准号: 16659458
• 负责人: 新川 秀一
• 金额: $ 2.11万
• 依托单位: Hirosaki University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2004
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2004 至 2005
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-16659458/
• 关键词: 器官培養コルチ器; 外有毛細胞; prestin; 運動能

目的:器官培養コルチ器を用いて、外有毛細胞(OHC)に周辺組織などの負荷がかかった状態での運動能を解析するための前年度に引き続き運動能の発現時期の検討を行った。方法:生後5日目(P5)から生後18日目(P18)までのC57BL/6Jマウスの頂回転より蝸牛を取り出し、1mg/mlのtrypsinで10〜15分間(室温)酵素処理した後、急性単離したOHCにwhole-cellパッチクランプ法を行いその膜容量の変化を測定した。測定および解析はjClampにて、two-sine voltage stimulus protocolを用いて行った。そこからprestinの電荷密度を計算した。またデジタルCCDカメラにてpatch clampを行ったOHCの画像を取り込み、AQUA-Lite VER1.2(HAMAMATSU)を用いて発達に伴うOHCの長さ、幅および表面積の変化を測定した。また、発達に伴うprestin mRNAの発現量を評価するためにP5、P8、P10、P15のコルチ器を用いてRT-quantitative PCR(QPCR)を行った。結果:マウスのOHCではP7からNLCが計測された。細胞膜の表面積を表すlinear-capacitance(C_<lin>)はP5からP9までは徐々に増加したがP10以降一定となった。表面積を計算したところC_<lin>と同様の変化が得られた。C_vはS字状の増加を示し、P18で7.66pFに達した。prestinの電荷密度もC_vと同様に上昇していた。また膜容量がピークとなるときの膜電位(V_<pkcm>)はP5からP10では大きく変動したが、P10以降では約-67mVに近づくような安定した脱分極方向への偏位を示した。QPCRの結果ではprestinのRNAレベルはP10頃にピークに達しており、今回の電気生理学的なデータと一致した。

Objective: To analyze the stress state of peripheral tissues in organ culture, and to investigate the development period of peripheral tissues in organ culture. Methods: C57BL/6J cells were extracted from the top of snails at P5 and P18 after birth, and the changes of membrane capacity were measured by enzyme treatment at room temperature for 10 ~ 15 minutes at 1mg/ml trypsin and acute isolation by whole-cell separation method. Determination of the voltage of the clamp, two-sine voltage stimulator protocol Calculate the charge density of prestin. A CCD patch clamp was used to determine the length, amplitude and surface area of OHC. RT-quantitative PCR(QPCR) was used to evaluate the expression of prestin mRNA in P5, P8, P10 and P15. Results: The OHC was measured at P7. The surface area of the cell membrane is linear-capacitance(C_<lin>), which increases from P5 to P9 and decreases from P10. The surface area is calculated by the same method<lin>. C_v increased in the shape of S, and P18 reached 7.66pF. The charge density of prestin increases with the increase of C_v. The membrane potential (V_ ) of the membrane capacity is about-67 mV, and the membrane potential (V<pkcm>_) of the membrane capacity is about-67 mV. The results of QPCR are consistent with those of prestin RNA and P10.