器官培養コルチ器を用いたprestinによる蝸牛増幅機構の直接的解析

点击翻译按钮获取中文摘要

目的:器官培養コルチ器を用いて、外有毛細胞(OHC)に周辺組織などの負荷がかかった状態での運動能を解析するための前年度に引き続き運動能の発現時期の検討を行った。方法:生後5日目(P5)から生後18日目(P18)までのC57BL/6Jマウスの頂回転より蝸牛を取り出し、1mg/mlのtrypsinで10〜15分間(室温)酵素処理した後、急性単離したOHCにwhole-cellパッチクランプ法を行いその膜容量の変化を測定した。測定および解析はjClampにて、two-sine voltage stimulus protocolを用いて行った。そこからprestinの電荷密度を計算した。またデジタルCCDカメラにてpatch clampを行ったOHCの画像を取り込み、AQUA-Lite VER1.2(HAMAMATSU)を用いて発達に伴うOHCの長さ、幅および表面積の変化を測定した。また、発達に伴うprestin mRNAの発現量を評価するためにP5、P8、P10、P15のコルチ器を用いてRT-quantitative PCR(QPCR)を行った。結果:マウスのOHCではP7からNLCが計測された。細胞膜の表面積を表すlinear-capacitance(C_<lin>)はP5からP9までは徐々に増加したがP10以降一定となった。表面積を計算したところC_<lin>と同様の変化が得られた。C_vはS字状の増加を示し、P18で7.66pFに達した。prestinの電荷密度もC_vと同様に上昇していた。また膜容量がピークとなるときの膜電位(V_<pkcm>)はP5からP10では大きく変動したが、P10以降では約-67mVに近づくような安定した脱分極方向への偏位を示した。QPCRの結果ではprestinのRNAレベルはP10頃にピークに達しており、今回の電気生理学的なデータと一致した。