课题基金 / 基金详情

外有毛細胞蛋白プレスチンの膜電位-細胞長変換の分子機構及び膜機能蛋白との機能協関

外有毛細胞蛋白プレスチンの膜電位-細胞長変換の分子機構及び膜機能蛋白との機能協関
外毛细胞蛋白prestin膜电位-细胞长度转换的分子机制及其与膜功能蛋白的功能关系
批准号：
16659053
负责人：
久保 義弘
金额：
$2.11万
依托单位：
National Institute for Physiological Sciences
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2005
资助国家：
日本
项目状态：
已结题
起止时间：
2005 至 --
来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-16659053/
关键词：
プレスチン外有毛細胞ゲート電流細胞収縮構造機能連関細胞長変化単粒子構造解析バキュロウイルス

项目摘要

项目成果

久保 義弘的其他基金

相似基金

相关文献

中文摘要
翻译
内耳の外有毛細胞は、膜電位変化に伴い伸縮しその細胞長を変える。10kHz超という驚異的に直速の膜電位変化にまで細胞長伸縮が追従するため、その機構は長く関心の的であった。2000年に、膜電位を細胞長に変換する分子として、陰イオントランスポーターSLC26ファミリーに属する分子"プレスチン"が同定された。「プレスチンによる膜電位-細胞長変換の分子機構とその生理的意義を明かにする」というゴールへ向けて、本研究では、プレスチン分子の単粒子構造解析を行うことを具体的目標として、その蛋白の精製を行った。プレスチンのN-もしくはC-末端にFLAG tagを付加したコンストラクトの作成、baculo virusベクターへの組み換えを行い、昆虫細胞Sf9に感染させることにより高タイターのbaculo virusを得た。また、プレスチンを認識する特異抗体の作成にも成功し、この抗体、およびFLAG抗体を用いて、Sf9細胞における発現を解析したところ、非常に強く細胞膜上に発現していることが確認された。感染Sf9細胞のストックをlarge scaleで作り、膜画分蛋白を、FLAG affinityカラム、および、ゲルろ過カラムで精製した。ゲル電気泳動し、銀染色およびWestern blottingにより精製を確認したところ、十分な収量の精製産物が得られていたが、かなりのaggregationが起きていた。今後、この点を克服するために、detergentの種類、pH緩衝剤の種類、溶液のイオン強度、glycerolやsucroseの添加濃度等の精製条件について系統的に検討すると共に、lipidの添加による蛋白の安定化も試みる。十分なクオリティーの精製蛋白が得られ次第、単一粒子構造解析に進む計画である。
英文摘要
内耳の外有毛細胞は、膜電位変化に伴い伸縮しその細胞長を変える。10kHz超という驚異的に直速の膜電位変化にまで細胞長伸縮が追従するため、その機構は長く関心の的であった。2000年に、膜電位を細胞長に変換する分子として、陰イオントランスポーターSLC26ファミリーに属する分子"プレスチン"が同定された。「プレスチンによる膜電位-細胞長変換の分子機構とその生理的意義を明かにする」というゴールへ向けて、本研究では、プレスチン分子の単粒子構造解析を行うことを具体的目標として、その蛋白の精製を行った。プレスチンのN-もしくはC-末端にFLAG tagを付加したコンストラクトの作成、baculo virusベクターへの組み換えを行い、昆虫細胞Sf9に感染させることにより高タイターのbaculo virusを得た。また、プレスチンを認識する特異抗体の作成にも成功し、この抗体、およびFLAG抗体を用いて、Sf9細胞における発現を解析したところ、非常に強く細胞膜上に発現していることが確認された。感染Sf9細胞のストックをlarge scaleで作り、膜画分蛋白を、FLAG affinityカラム、および、ゲルろ過カラムで精製した。ゲル電気泳動し、銀染色およびWestern blottingにより精製を確認したところ、十分な収量の精製産物が得られていたが、かなりのaggregationが起きていた。今後、この点を克服するために、detergentの種類、pH緩衝剤の種類、溶液のイオン強度、glycerolやsucroseの添加濃度等の精製条件について系統的に検討すると共に、lipidの添加による蛋白の安定化も試みる。十分なクオリティーの精製蛋白が得られ次第、単一粒子構造解析に進む計画である。
期刊论文(18)
专著(0)
科研奖励(0)
会议论文
Density Dependent Changes of the Pore Properties of P2X_2 Receptor
P2X_2 受体孔性质的密度依赖性变化
DOI： --
发表时间： 2004
期刊： Journal of Physiology 558
影响因子： --
作者： [Fujiwara, Y., Kubo, Y.]
通讯作者： Y.
Functional roles of charged amino acid residues on the wall of the cytoplasmic pore of Kir2.1
DOI： 10.1085/jgp.200509434
发表时间： 2006-04-01
期刊： JOURNAL OF GENERAL PHYSIOLOGY
影响因子： 3.8
作者： [Fujiwara, Y, Kubo, Y]
通讯作者： Kubo, Y
Biochemical and Physiological analyses of the RGS8 function
RGS8功能的生化和生理学分析
DOI： --
发表时间： 2004
期刊： Methods in Enzymology 390
影响因子： --
作者： [Saitoh, O, Kubo, Y.]
通讯作者： Y.
Ligand-induced rearrangement of the intracellular dimeric conformation of metabotropic glutamate receptor1a.
配体诱导的代谢型谷氨酸受体 1a 细胞内二聚体构象的重排。
DOI： --
发表时间： 2004
期刊： Nature Structural & Molecular Biology 11
影响因子： --
作者： [Tateyama, M., Abe, H., Nakata, H., Saitoh, O, Kubo, Y.]
通讯作者： Y.
共 8 条
    チャネルにおけるイオン透過と非典型的膜電位依存性ゲーティングのカップリングの検証
    チャネルにおけるイオン透過と非典型的膜電位依存性ゲーティングのカップリングの検証
    膜電位センサーを持たないATP受容体チャネルP2X2の膜電位依存的構造変化の解析
    TRPA1チャネルのカフェインに対する応答の質的種間差異に基づく活性化機構の解明
    海外基金