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外有毛細胞蛋白プレスチンの膜電位-細胞長変換の分子機構及び膜機能蛋白との機能協関

外毛细胞蛋白prestin膜电位-细胞长度转换的分子机制及其与膜功能蛋白的功能关系

基本信息

批准号：
16659053
负责人：
久保義弘
金额：
$ 2.11万
依托单位：
National Institute for Physiological Sciences
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

内耳の外有毛細胞は、膜電位変化に伴い伸縮しその細胞長を変える。10kHz超という驚異的に直速の膜電位変化にまで細胞長伸縮が追従するため、その機構は長く関心の的であった。2000年に、膜電位を細胞長に変換する分子として、陰イオントランスポーターSLC26ファミリーに属する分子"プレスチン"が同定された。「プレスチンによる膜電位-細胞長変換の分子機構とその生理的意義を明かにする」というゴールへ向けて、本研究では、プレスチン分子の単粒子構造解析を行うことを具体的目標として、その蛋白の精製を行った。プレスチンのN-もしくはC-末端にFLAG tagを付加したコンストラクトの作成、baculo virusベクターへの組み換えを行い、昆虫細胞Sf9に感染させることにより高タイターのbaculo virusを得た。また、プレスチンを認識する特異抗体の作成にも成功し、この抗体、およびFLAG抗体を用いて、Sf9細胞における発現を解析したところ、非常に強く細胞膜上に発現していることが確認された。感染Sf9細胞のストックをlarge scaleで作り、膜画分蛋白を、FLAG affinityカラム、および、ゲルろ過カラムで精製した。ゲル電気泳動し、銀染色およびWestern blottingにより精製を確認したところ、十分な収量の精製産物が得られていたが、かなりのaggregationが起きていた。今後、この点を克服するために、detergentの種類、pH緩衝剤の種類、溶液のイオン強度、glycerolやsucroseの添加濃度等の精製条件について系統的に検討すると共に、lipidの添加による蛋白の安定化も試みる。十分なクオリティーの精製蛋白が得られ次第、単一粒子構造解析に進む計画である。

The outer hairy cells of the inner ear are stretched and the membrane potential is changed. The membrane potential changes at 10kHz are amazing, and the length of the cell stretches. In 2000, the membrane potential of the cell length of the molecule, Yin, Si, Si "To clarify the physiological significance of membrane potential-cell length change," this study aims to analyze the molecular structure of cell length and protein purification. N-terminal FLAG tag is added to the C-terminal to create baculo virus, which is infected by insect cell Sf9. The production of specific antibodies was successful, and the use of such antibodies and FLAG antibodies in Sf9 cells was confirmed. Infected Sf9 cells have a large scale of infection, membrane protein, FLAG affinity, and purification. Electrophoresis, silver staining and Western blotting are used to confirm the purity and aggregation of refined products In the future, this point should be overcome such as the type of detergent, the type of pH buffer, the strength of the solution, the concentration of glycerol and sucrose, etc., the purification conditions of the system should be discussed, and the stability of the protein should be tested. The refined protein was obtained in order of magnitude and particle structure analysis.