精製サンプルを用いた外有毛細胞に存在する蛋白質モータprestinの電気特性解析

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内耳に存在する外有毛細胞の伸縮運動は, 我々の聴覚を鋭敏にしている蝸牛増幅機構の中心的な役割を担っている. この伸縮運動の動力源はタンパク質モータprestinである. これまでprestinの機能解析は, prestinを発現している細胞を用いて行われてきた. しかし細胞には, prestin以外のタンパク質や核酸等多種多様な生体分子が存在する. そのため細胞を用いた解析では純粋なprestinの機能を解析することは困難である. そこで本研究では, 精製したprestinを用い, 不要な生体分子がない状態で, 純粋なprestinの機能を解析することを目指している.平成20年度は, トシル基でコートされた常磁性ビーズを用いた精製prestinの脂質膜への再構成手法の確立を目指し, 以下を行った. まず, ビーズに抗FLAG抗体とストレプトアビジンを吸着させ, ここにFLAG-tag融合prestinを安定発現している細胞株より界面活性剤で可溶化して得た, FLAG-tag融合prestinを吸着させた. さらに, ビオチンを結合した脂質と結合していない脂質を界面活性剤入りの緩衝液に分散させ, ビーズに加えた後,透析で界面活性剤を取り除き, prestinが吸着しているビーズの周囲に脂質膜を展開させた.作製したビーズに抗FLAG抗体, ストレプトアビジン, FLAG-tag融合prestinが結合していることをSDS-ポリアクリルアミド電気泳動により確認した. また, ビーズの周囲に脂質膜が均一に展開していることを, 蛍光標識した脂質を共焦点レーザ走査型顕微鏡で観察することにより確認した.