歯胚形成遺伝子の選定と遺伝子導入による歯胚再生

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昨年度の本研究によって樹立した不死化歯乳頭細胞株(PA-1)に対するデキサメタソン(Dex)、ビタミンD3(VitD3)、スタチン(Stat)あるいはBMP2の作用を検討したところ、Dex、VitD3はPA-1のアルカリフォスファターゼ活性を上昇させたが、Stat、BMP2に対して全く反応しなかった。歯乳頭由来初代培養細胞はin vitroにおいて石灰化結節を形成するが、不死化細胞PA-1では上記の各種因子を作用させても石灰化結節を形成することはなかった。そこで、強力な骨芽細胞、象牙芽細胞分化誘導因子であるBMP4遺伝子を導入し、石灰化能の回復を試みた。PA-1に対する効率的遺伝子導入法を検討するため、超音波導入法、リポフェクション法、磁力遺伝子導入法を用いGFP発現プラスミドを導入した。その結果、磁力遺伝子導入法がPA-1に対し最も効率よく遺伝子を導入することが分かった。そこで、昨年度ヒト歯髄よりクローニングしたBMP4プラスミドをこの方法でPA-1に導入した。遺伝子導入をした細胞は薬剤耐性マーカーにより14クローンを選別した。このクローンから最もBMP4遺伝子の発現が高いものをreal time PCRを用い選別し、その後に実験に用いた。この遺伝子導入をした細胞はアルカリフォスファターゼやBMP4遺伝子の発現が上昇しているものの、in vitroで石灰化結節を形成することはなかった。また、ポリグリコール酸を担体としてこの細胞を播種し、ヌードマウス腎皮膜下に移植したが、硬組織の形成は見られなかった。PA-1はその遺伝子発現様式から歯乳頭細胞の性質を良く保存しているが、最も歯乳頭細胞に特徴的と言える性質である石灰可能を失っていた。また、この性質はBMP4遺伝子を導入することによっても回復することはなかった。