頭頚部癌細胞由来RNAヘリカーゼのクローニングと機能解析

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【目的】本年度の研究では、分離された頭頸部癌培養細胞から抽出した蛋白に対するポリクローナル抗体を作成し、遺伝子クローニングを行った。【方法】以下の方法で行った.1.頭頸部癌培養細胞から抽出したα-N-acetylgalactosaminidase活性を示す蛋白を抗原とし、ウサギを宿主としてポリクローナル抗体を作製した。2.頭頸部癌のHela細胞より抽出したmRNAを抽出し、1^<st> strand cDNAを調製後、UNIZAP XR VECTORに挿入してcDNAベクターライブラリーを作製した。ファージベクターのホストとしてXL-1 Blueを用いた。3.XL-1 Blueを用いてファージタイターは2.4×10^<12>Pfu/mlで、このファージライブラリーを用いてクローニングを行った。4.IPTGを添加したNZY平板培地に、ファージを吸着させたXL-1 Blueをまき、42℃の温度シフト後に形成されたプラークをブロッティング膜に転写させた。作製したポリクローナル抗体を用いてECL法によってクローンを検出した。【結果】Hela細胞より抽出した、約2500塩基のリーディングフレームを持つ新規mRNAをクローニングした。本蛋白は、DEVD Boxを有し、N末端側に塩基性アミノ酸配列と核移行シグナルが、またC末端側には回文構造がみられた。NCBIのBlastnによる解析では、RNAヘリカーゼ様構造を持つとともに、α-ガラクトシダーゼやグルクロニダーゼとの相同性もみられ、糖鎖構造を脱糖鎖する機能を有すると考えられた。