頭頚部癌細胞由来RNAヘリカーゼのクローニングと機能解析

头颈癌细胞RNA解旋酶的克隆及功能分析

• 批准号: 16659565
• 负责人: 古澤 清文
• 金额: $ 2.05万
• 依托单位: Matsumoto Dental University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2004
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2004 至 2005
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-16659565/
• 关键词: 頭頸部癌; ヘリカーゼ; 酵素; RNAヘリカーゼ; クローニング; cDNAライブラリー

【目的】本年度の研究では、分離された頭頸部癌培養細胞から抽出した蛋白に対するポリクローナル抗体を作成し、遺伝子クローニングを行った。【方法】以下の方法で行った.1.頭頸部癌培養細胞から抽出したα-N-acetylgalactosaminidase活性を示す蛋白を抗原とし、ウサギを宿主としてポリクローナル抗体を作製した。2.頭頸部癌のHela細胞より抽出したmRNAを抽出し、1^<st> strand cDNAを調製後、UNIZAP XR VECTORに挿入してcDNAベクターライブラリーを作製した。ファージベクターのホストとしてXL-1 Blueを用いた。3.XL-1 Blueを用いてファージタイターは2.4×10^<12>Pfu/mlで、このファージライブラリーを用いてクローニングを行った。4.IPTGを添加したNZY平板培地に、ファージを吸着させたXL-1 Blueをまき、42℃の温度シフト後に形成されたプラークをブロッティング膜に転写させた。作製したポリクローナル抗体を用いてECL法によってクローンを検出した。【結果】Hela細胞より抽出した、約2500塩基のリーディングフレームを持つ新規mRNAをクローニングした。本蛋白は、DEVD Boxを有し、N末端側に塩基性アミノ酸配列と核移行シグナルが、またC末端側には回文構造がみられた。NCBIのBlastnによる解析では、RNAヘリカーゼ様構造を持つとともに、α-ガラクトシダーゼやグルクロニダーゼとの相同性もみられ、糖鎖構造を脱糖鎖する機能を有すると考えられた。

[Objective] This year's study was conducted to isolate and extract protein from head and neck cancer culture cells, and to prepare antibody and protein. [Methods] The following methods were used: 1. Extraction of α-N-acetylgalactosaminase activity from cultured head and neck cancer cells 2. The expression of mRNA in Hela cells of head and neck cancer was extracted, and the expression of <st>cDNA was modulated by UNIZAP XR VECTOR The best way to get started is to use XL-1 Blue. 3.XL-1 Blue is used in the production of 2.4×10^ Pfu/ml, the production of 2.4×10^<12>Pfu/ml, and the production of 2.4 × 10 ^Pfu/ml. 4. IPTG was added to the NZY plate culture medium, and then the XL-1 Blue was adsorbed at 42℃. To control the development of anti-inflammatory drugs, the ECL method was used. [Results] Hela cells were isolated from about 2500 cells, and the expression of mRNA was detected by PCR. This protein has a DEVD Box, a N-terminal side, a basic acid sequence, a nuclear transition, and a C-terminal side, a palindrome. NCBI's Blastn analysis is based on the analysis of RNA, RNA, α-RNA, α-RNA,