魚類免疫学実験モデルとしてのGFPトランスジェニッククローンギンブナの作製

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1.GFP発現トランスジェニックギンブナ系統の確立1)EF-1プロモーターにEGFP遺伝子を連結したコンストラクトとI-Scelメガヌクレアーゼを共に胚に注入し、育成したギンブナが現在193尾得られている。鰭や筋肉等に蛍光が認められるが、成熟までにまだ少し時間を要する。今後、卵における蛍光の発現を観察することにより、F1個体におけるEGFP遺伝子の伝達を確認する予定である。2)メダカトランスポゾン(Tol2)トランスポゼースmRNA及びTol2配列の一部にEF-1αプロモーターとGFP遺伝子配列を組み込んだコンストラクトを同時にゼブラフィッシュ受精卵に注入したところ、I-Scelメガヌクレアーゼ法等に比べ高いGFPの発現および次世代への伝達が認められた。そこで、ギンブナ受精卵を用いて検討した結果、29個体中18個体(62%)で蛍光が観察され,強い発現を示す個体が2個体(7%)、中程度が7個体(24%)、弱い発現を示す個体が9個体(31%)認められた。現在、次世代への伝達について検討中である。2.細胞障害性Tリンパ球特異的GFP発現トランスジェニック魚の確立1)ゼブラフィッシュを用いて、フグCD8p+GFPを導入したF0個体を150尾作製した。これまでに、F0とAB系統魚を掛け合わせたF1を作製しPCR法により検討する方法を用いて56個体のスクリーニングを終えているが、遺伝子が導入されたF0個体は見つかっていない。現在もスクリーニングを継続中である。2)CD8トランスジェニックゼブラフィッシュの作製と並行して、トランスジェニック魚の解析・評価手法を確立するために、個体発生に伴う内因性CD8αおよびCD8β遺伝子の発現時期及び部位についてRT-PCR法により検討した。その結果、CD8αは受精後2日目、CD8βは1日目より発現がみられ、いずれも胸腺において最も強い発現が認められ28日目以降発現が増強した。