Stable Isotope Probing法を用いた土壌の脱窒微生物群の同定

稳定同位素探测法鉴定土壤反硝化微生物

基本信息

批准号：
17658149
负责人：
妹尾啓史
金额：
$ 1.79万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至 2006
项目状态：
已结题

项目摘要

農耕地においては硝酸性窒素による地下水汚染ならびに温室効果ガスである亜酸化二窒素(N_2O)の生成が大きな環境問題となっている。これらを解決するためには「脱窒の制御」が望まれる。そのためには、従来ブラックボックスであった、土壌において脱窒反応を活発に行っている微生物のメンバーを明らかにする必要がある。本研究は環境中で実際に機能している微生物集団を特定する方法であるStable Isotope Probing法を湛水土壌に適用して行い、「湛水土壌で実際に脱窒に寄与している土壌微生物メンバーの同定」を行い、脱窒の制御へ向けての基礎的情報を得ることを目的として行った。水田土壌(東大田無農場から採取)に硝酸ナトリウムと13Cで標識した脱窒菌の基質を添加してバイアルびんに入れ、気相をアルゴン-アセチレン混合ガスで置換してインキュベートした。インキュベートの条件は平成17年度に決定した通りである。インキュベート後、土壌からDNAを抽出し、密度勾配超遠心により13C-DNAと12C-DNAとを分画し、13C-DNAを回収した。このDNAを鋳型として16S rRNA遺伝子をPCR増幅し、クローニング・シーケンスを行った。約50クローンについてシーケンスし、データベースによる相同性検索を行った結果、この土壌インキュベート系においてはDenitratisoma, DechloromonasなどのRhodocyclaceaeに属する脱窒菌群が優占していること、また、Oxalobacteraceaeに属する細菌群が出現していることが明らかになった。

在农业土地上，由硝酸盐氮引起的地下水污染和一氧化二氮（N_2O）的产生是一种主要环境问题。为了解决这些问题，需要“反硝化控制”。为此，有必要阐明在以前是黑匣子的土壤中积极硝化的微生物成员。这项研究是使用稳定的同位素探测方法进行的，这是一种识别实际在环境中起作用的微生物种群，对土壤泛滥的方法，并进行进行，目的是获得控制反硝化的基本信息。将稻田（取自Higashi-dae Tetsunami农场取材）被添加到硝酸钠和13C标记的硝化细菌底物中，放置在小瓶瓶中，并将气相用氩气混合的气体代替，并将其代替。孵育的条件在2005年确定。孵育后，从土壤中提取DNA，并通过密度梯度超速离心分离13c-DNA和12C-DNA，并收集13C-DNA。使用此DNA作为模板，将16S rRNA基因放大并进行克隆序列。对大约50个克隆进行了测序，并使用数据库搜索了同源性，表明在该土壤孵化系统中，属于犀牛科的非硝化细菌，例如硝酸酯和脱氯瘤，主要主导了土壤孵化系统，以及属于Oxalobacteracteracteraceae的细菌出现了。