タンパク質の新規N末端特異的修飾法の開発とDNAリンクタンパク質の創製

开发新型蛋白质 N 末端特异性修饰方法并创建 DNA 连接蛋白质

• 批准号: 18651068
• 负责人: 横川 隆志
• 金额: $ 2.24万
• 依托单位: Gifu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2006
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2006 至 2007
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-18651068/
• 关键词: Leucyl; phenylalanyl-tRNA; Protein transferase; 化学修飾; Click chemistry; エチニルフェニルアラニン; Phenylalanyl-tRNA synthetase; アジド化合物; Staudinger-Bertozzi ligation; Staudinger reaction; アジドフェニルアラニン; SUMOプロテアーゼ; Arginyl-tRNA

本年度の課題は、Leucyl/Phenylalanyl-tRNA Protein Transferaseを利用するタンパク質のN末端修飾法の修飾効率がこれまで低かった点を改善し、実際に、タンパク質のN末端にDNAを結合させることであった。これまではN末端へのアジドフェニルアラニン導入効率をいかに高めるかについて条件検討を行ってきたが、アジド基選択的な修飾法として、これまで当研究室で利用してきたStaudinger-Bertozzi ligationよりも、Crick chemistryとして知られるアジド基とアセチレン誘導体のHuisgen 1,3-dipolar cycloadditionの方が修飾効率が高いことが判明したので、方針を転換してオリゴDNAの末端にアジド基を、タンパク質のN末端にはアセチレン誘導体であるエチニルフェニルアラニンを導入する系を構築することにした。まず当研究室で取得済みのフェニルアラニルtRNA合成酵素変異体(T415G)を用いてtRNAにエチニルフェニルアラニンが受容できるか検討したところ、T415Gにとってエチニルフェニルアラニンはアジドフェニルアラニンよりも1.5倍よい基質であることがわかった。次にαカゼインをモデルタンパク質として用いて、エチニルフェニルアラニンがN末端に導入され、さらに導入されたエチニル基がアジドフルオレセインとHuisgen 1,3-dipolar cycloadditionによって蛍光修飾されることを確かめた。残念ながら、オリゴDNAの末端に導入されたアミノ基をアジド基に変換する試薬の入手が遅れ、まだDNAをタンパク質のN末端に導入する実験を行えていない。今後、速やかにDNAリンクタンパク質の作製を試みたい。

は の subject this year, Leucyl/Phenylalanyl - tRNA Protein Transferase を using す る タ ン パ ク quality の N terminal の modification method modified sharper rate が こ れ ま で low か っ た point を improve し, the event be に, タ ン パ ク qualitative の N terminal に DNA を combining さ せ る こ と で あ っ た. こ れ ま で は N terminal へ の ア ジ ド フ ェ ニ ル ア ラ ニ ン import working rate を い か に high め る か に つ い 検 て conditions for line を っ て き た が, ア ジ ド base sentaku な oxymoron と し て, こ れ ま で when laboratory で use し て き た Staudinger - Bertozzi ligation よ り も, Crick Chemistry と し て know ら れ る ア ジ ド base と ア セ チ レ ン inductor の Huisgen 1, 3 - dipolar Cycloaddition の party が modified high rate of unseen が い こ と が.at し た の で, principles を planning in し て オ リ ゴ DNA の end に ア ジ ド を, タ ン パ ク qualitative の N terminal に は ア セ チ レ ン inductor で あ る エ チ ニ ル フ ェ ニ ル ア ラ ニ ン を import す る department を build す る こ と に し た. ま ず when laboratory で 済 み の フ ェ ニ ル ア ラ ニ ル tRNA synthetic enzyme - variants (T415G) を い て tRNA に エ チ ニ ル フ ェ ニ ル ア ラ ニ ン が by let で き る か beg し 検 た と こ ろ, T415G に と っ て エ チ ニ ル フ ェ ニ ル ア ラ ニ ン は ア ジ ド フ ェ ニ ル ア ラ ニ ン よ り も 1.5 times よ い matrix で あ Youdaoplaceholder0 とがわ った った. Time に alpha カ ゼ イ ン を モ デ ル タ ン パ ク qualitative と し て in い て, エ チ ニ ル フ ェ ニ ル ア ラ ニ ン が N terminal に import さ れ, さ ら に import さ れ た エ チ ニ ル base が ア ジ ド フ ル オ レ セ イ ン と Huisgen 1, 3 - dipolar cycloadditionによって蛍 light modification される とを とを confirmation めた めた. Remnants read aloud な が ら, オ リ ゴ DNA の end に import さ れ た ア ミ ノ base を ア ジ ド base に variations in す る try 薬 の of が 遅 れ, ま だ DNA を タ ン パ ク qualitative の N terminal に import す る be 験 を line え て い な い. In the future, quickly fabricating を test みた みた of や にDNAリ タ タ パ パ パ samples.

项目成果

Detection of structural changes in a cofactor binding protein by using a wheat germ cell-free protein synthesis system coupled with unnatural amino acid probing

• DOI: 10.1002/prot.21341
• 发表时间: 2007-05-15
• 期刊: PROTEINS-STRUCTURE FUNCTION AND BIOINFORMATICS
• 影响因子: 2.9
• 作者: Abe, Masato;Ohno, Satoshi;Endo, Yaeta
• 通讯作者: Endo, Yaeta

Crystallization and preliminary X-ray crystallographic analysis of yeast tyrosyl-tRNA synthetase complexed with its cognate tRNA.

酵母酪氨酰-tRNA 合成酶与其同源 tRNA 复合的结晶和初步 X 射线晶体分析。

• 发表时间: 2006
• 期刊: Protein Pept. Lett. 13・4
• 作者: Tsunoda M.;et. al.;Fukunaga J. et al.;Kenichi Yoshikawa;Kusakabe Y. et al.
• 通讯作者: Kusakabe Y. et al.

Site-selective post-translational modification of proteins using an unnatural amino acid, 3-azidotyrosine

• DOI: 10.1093/jb/mvm036
• 发表时间: 2007-03-01
• 期刊: JOURNAL OF BIOCHEMISTRY
• 影响因子: 2.7
• 作者: Ohno, Satoshi;Matsui, Megumi;Nishikawa, Kazuya
• 通讯作者: Nishikawa, Kazuya

Structural basis for recognition of cognate tRNA by tyrosyl-tRNA synthetase from three kingdo

三界酪氨酰-tRNA合成酶识别同源tRNA的结构基础

• 发表时间: 2007
• 期刊: Nucleic Acids Res. 35
• 作者: Tsunoda M.;et. al.
• 通讯作者: et. al.

Misacylation of yeast amber suppressor tRNA^<lyr> by E. coli lysyl-tRNA synthetase and its effective repression by genetic engineering of the tRNA sequence.

大肠杆菌赖氨酰-tRNA合成酶对酵母琥珀抑制子tRNA^<lyr>的错酰化及其通过tRNA序列的基因工程的有效抑制。

• 发表时间: 2006
• 期刊: J. Biochem. (Tokyo) 139・4
• 作者: Tsunoda M.;et. al.;Fukunaga J. et al.;Kenichi Yoshikawa;Kusakabe Y. et al.;北畑裕之;Fukunaga J. et a1.
• 通讯作者: Fukunaga J. et a1.