バクテリアのタンパク質合成系に関与する未知遺伝子群の探索

寻找参与细菌蛋白质合成系统的未知基因

基本信息

批准号：
16013215
负责人：
横川隆志
金额：
$ 2.37万
依托单位：
Gifu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

タンパク質合成系に関与するとされる教科書的なタンパク質性因子をすべて純化し系を再構築したタンパク質合成系(PUREシステム)の翻訳効率がさほど良くないことから、タンパク質合成にはまだ知られていない遺伝子が存在するのではないかと考えた。タンパク質合成は生物にとって非常に重要なイベントであることから、この遺伝子はすべてのバクテリアに共通すると考え、BuchneraとM.genitalium G37に共通する遺伝子のうち機能が確定しない遺伝子数を見積もったところ、たかだか30しか存在しないことが明らかとなった。このうちタンパク質合成に関与しそうなgidA, efpの他、高度に保存されていたGTP結合タンパク質、mnmE、era、lepA、yihA、ychF、yhbZ、engAをクローニングし、遺伝子産物をすべてヒスチジンタグを融合させて調製した。これらをPUREシステムに添加したが、どのタンパク質を加えた場合でもタンパク質合成の顕著な促進も阻害も認められなかった。このことは、これらのタンパク質は少なくとも1つではタンパク質合成系に関与していないと考えられる。しかしこれらの多くが文献上、リボソームと作用することが指摘されていることから、このうち複数が協調的に作用している可能性も考えられる。そこで発現させたタンパク質をNiカラムに固定化し、これをアフィニティークロマトグラフィーに見立てて、相互作用するタンパク質を分離し質量分析にかけて分離されたタンパク質を同定した。もしもバクテリアにとって必須な機能を有しているなら、相互作用する相手分子もやはり保存性の高いタンパク質だと考えられる。しかし現在のところ、EF-Tu以外に保存性の高いタンパク質は認められなかった。EF-Tuは細胞中にたくさん含まれるため、非特異的な相互作用の可能性もあり、慎重に解析を進めている。

由于蛋白质合成系统的翻译效率（纯系统）净化了所有教科书的蛋白质因子，这些蛋白质因子涉及蛋白质合成系统并重建该系统，因此不是很好，我们认为可能存在一些在蛋白质合成中尚不知道的基因。由于蛋白质合成是生物体的一个非常重要的事件，因此该基因在所有细菌中都是共同的，并且当我们估计Buchnera和M. Genitalium g37常见的基因数量尚无功能证实，因此发现其中只有30个。其中，除了可能与蛋白质合成有关的GIDA和EFP之外，将高度保守的GTP结合蛋白（例如MNME，ERA，LEPA，LEPA，YIHA，YIHA，YHBZ，YHBZ和ENGA）克隆了，并通过融合使用小键蛋白来制备所有基因产物。这些被添加到纯系统中，但是当添加任何蛋白质时，未观察到蛋白质合成的显着促进或抑制。这似乎是至少其中一种蛋白质与蛋白质合成系统无关。但是，由于其中许多在文献中指出了它们对核糖体作用，因此其中一些可能以协调的方式起作用。然后将表达的蛋白固定在Ni柱上，并用来描述亲和力色谱分离相互作用的蛋白质并通过质谱鉴定分离的蛋白质。如果它具有细菌的重要功能，则相互作用的伴侣分子也被认为是高度保守的蛋白质。但是，截至目前，除了EF-TU以外，还没有发现高度保护的蛋白质。由于EF-TU在细胞中大量发现，因此存在非特异性相互作用的可能性，并且正在仔细进行分析。