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分子進化工学を用いたチロシルtRNA合成酵素のアミノ酸特異性のスイッチング

利用分子进化工程切换酪氨酰-tRNA合成酶的氨基酸特异性

基本信息

批准号：
14704067
负责人：
横川隆志
金额：
$ 15.23万
依托单位：
Gifu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (A)
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至 2004
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-14704067/
关键词：
非天然アミノ酸アミノアシルtRNA合成酵素分子進化工学アジドチロシン部位特異的修飾トリプトファン酵母ミトコンドリア orthogonal tRNA ミスアミノアシル化フェニルアラニン tRNA orthogonal サプレッサー不和合性

项目摘要

アミノアシルtRNA合成酵素(aaRS)遺伝子を部位特異的に改変する手法では、酵素のアミノ酸特異性が劇的に変換されたような酵素を得ることは難しいと考えられる。分子進化工学的手法を生細胞に適用して、非天然アミノ酸を認識するaaRSを得ようと試みたが、生細胞に適用する場合、細胞に影響を与えるaaRSやサプレッサーtRNAの発現量に、なにがしかの「しきい値」が存在し、細胞がよくわからない応答をすることに悩まされた。その結果、有効な選別法を確立するに至らず、非常に残念である。一方、現在得られているチロシルtRNA合成酵素改変体がタンパク質には存在しないアジドチロシンを基質として認識できることを利用して、標的タンパク質の部位特異的に、蛍光、ビオチン、ポリエチレングリコール修飾が行える手法を考案し、実際に部位特異的に修飾が行えることを示した。また、非天然アミノ酸のバリエーションを広げることを念頭に、酵母ミトコンドリアトリプトファニルtRNA合成酵素とトリプトファンtRNAがコムギなどの真核生物由来のタンパク質合成系において非天然アミノ酸用の組み合わせになり得ることを示した(特許出願中)。また酵母フェニルアラニルtRNA合成酵素の改変によりトリプトファンを効率よくtRNAに結合する酵素変異体を見いだした。さらに詳しく解析したところ、この酵素変異体はトリプトファン以外にチロシンも活性化するが、tRNAに結合させないことが明らかとなった。すなわち、酵母フェニルアラニルtRNA合成酵素には、チロシン特異的にミスアミノアシル化を防ぐ校正機構が存在することを明らかにした。今後、非天然アミノ酸が校正されるかどうかを検証していくことで、非天然アミノ酸含有タンパク質を効率よく合成することが可能か否か明らかにしたい。

A site-specific modification of the aaRS gene sequence is performed by a method known as a "reverse transcription" method, and a method known as a "reverse transcription" method is performed by an enzyme known as a "reverse transcription" method. Molecular evolutionary engineering techniques are applicable to biological cells, non-natural acids, biological conditions, cellular effects, and the presence of non-natural acids. The result, the selection method, the determination of the number, the number, and the number of On the other hand, we have now obtained a method for the modification of tRNA synthase by using site-specific, fluorescent, and fluorescent techniques for the modification of tRNA synthase. In this paper, the author discusses the mechanism of the synthesis of non-natural acids, yeast and tRNA synthetases, and the mechanism of the synthesis of non-natural acids. The yeast is a protein that binds to tRNA. In addition to the analysis, the enzyme is active in the presence of tRNA. The enzyme activity of the yeast and the tRNA synthase is very important for the prevention of the occurrence of the disease. In the future, non-natural acids may be corrected, but they may not be synthesized.